Bakterizide Aktionen einer Silberionenlösung auf Escherichia coli, untersuchte mit Energie-Filtering
Bakterizide Wirkungen des Silberions auf Escherichia coli als Modellmikroorganismus wurde energiefilternden Transmissions-Elektronenmikroskopie (EFTEM), zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) und Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Time-of-flight suchte unter Verwendung von Massen Spektrometrie (MALDI-TOF MS). EFTEM Beobachtungen gezeigt, dass die Silberionen leicht in das Innere des E. coli infiltriert. im Gegensatz zu der frühen Hypothese, dass es zunächst in dem Zellmembran Bereich befindet. Weiterhin, 2-DE und MALDI-TOF MS zeigten, dass die Expression eines ribosomalen Untereinheit-Proteins sowie die irgendeinen andere Enzyme und Proteine, die durch die Silberionen beeinflusst wird. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass eine der wichtigsten Funktionen des bakteriziden Silberion ist seine Wechselwirkung mit dem Ribosom und der anschließenden Hemmung der Expression der Enzyme und Proteine wesentlich für die ATP-Produktion.
Experimentelle Details sind wie folgt. Eine wässrige Lösung mit einer Silberionenkonzentration von 900 ppb wurde elektrolytisch zwischen zwei Silberplattenelektroden für 28 s durch Anlegen eines Stroms von 12,5 mA, hergestellt in Wasser installiert. Der Restchlorgehalt in Wasser war weniger als 0,2 mg / Liter. Die Silberionenkonzentration in der erhaltenen Lösung wurde mit einem Hitachi-Z-5010 polarisierte Zeeman Atomabsorptionsspektrophotometer gemessen. Als Referenz wurde eine 0-ppb-Lösung auch hergestellt, ohne Elektrolyse.
Als Modell Mikroorganismus, gram-negative E. coli NBRC-3972 verwendet wurde. Zehn Milliliter der wässrigen Suspension mit 10 7 bis ~ 10 8 CFU / ml E. coli, umgesetzt mit 90 ml einer Silberionenlösung für 30 min, 3 h und 24 h. Lebensfähige Zellen wurden auf einer Agarplatte aufgezählt, die 1 g / Liter Glucose, 2,5 g / l Hefeextrakt und 5 g / l Trypton durch die Kolonie Zählverfahren nach Inkubation bei 35 ° C für 24 h.
Für morphologische Beobachtung und Elementaranalyse unter Verwendung von EFTEM, E. coli-Zellen, die mit dem Silberionen zur Reaktion gebracht wurden zuerst in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer bei 4 ° C in 2% Glutaraldehyd fixiert. Nach dem mit 0,1 M Cacodylat-Puffer gewaschen worden war, wurde die Suspension in 2% Osmiumtetroxid bei 4 ° C für 4 h und dann dehydratisiert osmicated wiederholt mit erhöhten Konzentrationen von Ethanol. Die fixierten Zellen wurden für 48 h bei 60 ° C in Epoxidharz eingebettet und geschnitten in eine etwa 50-nm-dicken EFTEM Probe durch einen Leica EM UC6 Ultramikrotom verwenden. Die Probe wurde dann mit einem amorphen Kohlenstofffilm beschichtet. Es wurde ferner positiv mit Uranylacetat und Bleicitrat für morphologische Beobachtung gefärbt.
Verwendung von Energiedispersionsröntgenspektroskopie (EDX), um die Elektronensonde wurde für die Elementaranalyse bei halbem Maximum von 0,9 nm mit einer vollen Breite fokussiert. Da das Signal-zu-Rausch-Verhältnis für die Elementar Mapping unzureichend war, wurden die Daten Punkt für Punkt mit einer Analysezeit von 2000 s pro Spot erworben. Die Strahlposition war ausreichend stabil, in dem Maße, dass die Drift betrug weniger als 1 nm bei der Analyse.
Für Proteomanalyse unter Verwendung von 2-DE und MALDI-TOF MS, das E. coli-Suspensionen, die mit 900-ppb und 0-ppb Silberionenlösungen umgesetzt 3 h verwendet wurden. Beide Proben wurden für 20 min bei 2.900 × g bei 4 ° C zentrifugiert und die Niederschläge wurden in Lysepuffer und zerbrochenen in einem Mikrozentrifugenröhrchen in Eis mit einer Ultraschallsonde für 30 s eingetaucht, suspendiert. Nach der Zentrifugation bei 1.600 × g für 30 min enthielten die Überstände lösliche hydrophile Proteine. Die Menge der Proteinprobe für die Analyse wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-Protein-Assay-Verfahrens bei 0,4 mg / ml fixiert.
In der ersten Dimension wurden die Proteine in 11-cm-langen immobilisierte pH-Gradienten (IPG) Gelen mit einer nicht-linearen Gradienten getrennt im Bereich von pH 3 bis 10. Die IPG-Gele mit einer 185-ul Rehydratationslösung, enthaltend die Proteinproben wurden bei rehydratisiert 20 ° C für 12 h. Die isoelektrische Fokussierung wurde eine Bio-Rad Protean IEF Zellsystem durchgeführt, unter Verwendung von, mit der Maximalspannung bei 8000 V.
Abbildung 2 zeigt die Nullverlust TEM-Bilder der Zellstrukturen mit elastisch transmittierten Elektronen erhalten. Die Zellen, die für 24 h zeigten eine normale Morphologie von E. coli mit einer 0-ppb-Lösung umgesetzt. mit einer mehrschichtigen Oberfläche des äußeren Membran, die Peptidoglycan-Schicht in periplasmatischen Raum besteht, und die Cytoplasmamembran (Fig. 2A und B). Obwohl die entsprechenden TEM-Bilder nicht dargestellt werden, werden die Zellen, die für 30 min und 3 h angegeben scheinbar normale Morphologie, die analog zu derjenigen in Fig. 2A und B ohne eine wahrnehmbare Verschlechterung der Membranstrukturen mit einer 900-ppb-Lösung umgesetzt. Im Gegensatz dazu ist die mit einer 900-ppb-Lösung exponierten Zellen für 24 h zeigten verschiedene Phasen in dem Prozess des Zelltods (Fig. 2C und D). In Fig. 2C. das entspricht einer Zwischenstufe des Zellaufschlusses, Plasmolyse und teilweise Verschwinden der Cytoplasmamembran beobachtet. Die Struktur des äußeren Membran ist in dieser Phase anscheinend nicht betroffen, und die Zelle nimmt eine verformte Morphologie, mit teilweise Fehlen des Cytoplasmamembran. In Fig. 2D. das entspricht offensichtlich dem Endstadium des Zellaufschlusses, ist die äußere Membran progressiv verloren und das Cytoplasma tendiert aus der Zelle zu verschütten.
Die EDX-Ergebnisse (Fig. 3) zeigen, dass nach einer relativ kurzen Reaktionszeit von 30 min, Silber bereits im Innern von E. coli nachgewiesen wurde. Dies wird an den Zellmembran Bereich gegenübergestellt, in denen Silber nicht trotz wiederholten Messungen an verschiedenen Stellen erkannt wurde. Es sollte angemerkt werden, dass Silber manchmal im Innern von E. coli festgestellt wird, aber nicht immer, mit Schwefel. Osmium und Chlor wurden als Artefakte aufgrund von Probenvorbereitung festgestellt. Das elektronendichten Teilchen im Zytoplasma beobachtet in Fig. 2C ist durch Kondensation von Osmiumtetroxid für Zellfixierung verwendet wird, und sie sind nicht Silber-Aggregate. Bei längerer Reaktionszeiten von 3 und 24 h beträgt die Menge an akkumulierten Silber von EDX geschätzten Zählungen kaum erhöht (Daten nicht gezeigt).
Abschließend bakterizide Wirkungen einer Silberionenlösung auf E. coli wurden durch EFTEM gekennzeichnet, 2-DE, und MALDI-TOF MS. Es wurde bestätigt, dass die Silberionen leicht in das Innere des E. coli infiltriert. als nicht in der Zellmembran Bereich aufhalten, durch EFTEM beobachtet. Eine nachfolgende Analyse unter Verwendung von 2-DE und MALDI-TOF MS zeigte, daß eine ribosomale Untereinheit-Protein und einige Enzyme und Proteine, die durch das Silberion betroffen waren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass eine der großen bakteriziden Wirkungen des Silberions durch seine Wechselwirkung mit dem Ribosom und anschließender Unterdrückung der Expression von Enzymen und Proteinen wesentlich für die ATP-Produktion hervorgerufen wird. Der vorliegende Ansatz könnte auf andere Studien mit dem Silberion, wie Studien seiner Wirkungen auf die Lebensfähigkeit der Mikroben aus dem von E-coli mit einem unterschiedlichen Zellhülle bezogen erweitert werden.
Lebensfähigkeit von E. coli-Zellen gegenüber der Zeit, als Folge von Reaktionen mit 900 ppb und 0-ppb Silberionenlösungen. Lebensfähige Zellen wurden auf einer Agarplatte aufgezählt, die 1 g / Liter Glucose, 2,5 g / l Hefeextrakt und 5 g / l Trypton durch die Kolonie Zählverfahren nach Inkubation bei 35 ° C für 24 h.