Dramatische Verbesserung der Proteom-Analyse von Zebrabärbling Lebertumor durch effektive Proteinextraktion

Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 14 Wissenschaft Drive 4, Singapur 117543

Academic Editor: Mohamed Abdel-Rehim

Die Mehrheit der Proteom-Untersuchungen an Gewebeproben beinhaltet die Verwendung von Gel-basierten Ansatz für die Profilierung und die Verdauung. Der aufwendige Gel-basierter Ansatz wird langsam durch den fort in-Lösung Verdauung Ansatz ersetzt. Jedoch gibt es immer noch einige Schwierigkeiten, wie beispielsweise schwer zu solubilisieren Proteinen, schlechte Proteomanalyse in komplexen Gewebeproben, und die Anwesenheit von Probenverunreinigungen. Von nun an gibt es eine große Nachfrage einen hocheffiziente Proteinextraktionspuffer mit hohen Proteinextraktionseffizienz von Gewebeproben, hohe Kompatibilität mit in-Lösung Verdauung, reduzierte Anzahl von Probenhandhabungsschritten zu formulieren Probenverlust, geringer Zeitaufwand, niedrig Kosten zu reduzieren, und die einfache Nutzung. Hier untersuchten wir verschiedene bestehende Proteinextraktionspuffer mit Zebrabärbling Lebertumorproben und gefunden, dass Natrium deoxycholate- (DOC), basierend Extraktionspuffer mit Hitzedenaturierung war der effektivste Ansatz für eine hocheffiziente Extraktion von Proteinen aus komplexen Geweben wie der Zebrabärbling Lebertumor . Insgesamt 4.790 Proteine ​​wurden mit Schrotflinte Proteomik Ansatz mit 2D-LC, die unser Wissen identifiziert die umfassendste Studie für Zebrabärbling Lebertumor Proteom ist.

1. Einleitung

Es wird immer wichtige Proteine, um zum Profil biologische Prozesse in einer postgenomischen Ära wie die Dynamik von Proteinen zwischen den Zellen zu verschiedenen Zeiten und unter verschiedenen Umweltbedingungen bieten einen tatsächlichen biologischen Phänotyp zu verstehen. Insbesondere hebt die Anwesenheit von post-translationalen Modifikationen in Proteinen weiter die Bedeutung der Proteomanalyse, die durch andere genomische Ansätze nicht ersetzbar ist [1]. Um das Proteom von Gewebeproben-Profil, haben die Proteine ​​extrahiert werden relevante Lösungsmittel. Derzeit gibt es zwei wichtige Ansätze, um die Gewebeproben für die Proteomanalyse vorzubereiten. Der erste Ansatz, bezeichnete als Gelbasis Trennung und In-Gel-Verdauung, beinhaltet die Verwendung von Detergenzien, wie SDS, die die Proteine ​​vor der Trennung durch SDS-PAGE und anschließenden Verdau der Proteine ​​im Gel [2] gefangen zu solubilisieren. Der zweite Ansatz, bezeichnet als in-Lösung-Verdauung, die Verwendung von starken chaotropen Reagenzien wie Harnstoff und Thioharnstoff umfasst die Proteine ​​zu solubilisieren, bevor die Proteine ​​in der Lösung, Digerieren [3].

In dieser Studie haben wir verschiedene bestehende Proteinextraktionspuffer (SDS, RIPA, Harnstoff, 2D, Natriumdeoxycholat (DOC) und Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) / Harnstoff / Triton-X / SDS (TUTS) [14] Puffer) für ihre Proteinextraktion und Solubilisierung Effizienz für in-Lösung-Verdau 1D- SDS-PAGE und shotgun Proteomik Ansätze. Vergleich der Wirksamkeit dieser Ansätze verwendet wurden, zeigten, dass DOC war der effizienteste Proteinextraktionspuffer in unserer Studie. Unsere Ergebnisse liefern Beweise, die für die wirksame Anwendung von DOC-basierten Protein-Extraktionspuffern in MS-basierten Proteom-Studien über den gesamten Zebrabärbling Lebertumor und unser Verfahren zu anderen Gewebeproben in verschiedenen Organismen, die für die Proteomik-Analyse angewandt werden könnte.

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Alle Reagenzien waren von ACS-Qualität oder höher; Alle verwendeten Lösungsmittel, einschließlich Wasser, waren von LC / MS Klasse. Harnstoff, SDS, DOC, Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), Phosphorsäure und Ameisensäure wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) erworben. Sequenziergrad Trypsin wurde von Promega (Madison, WI) erhalten. Methylmethanthiosulfonat (MMTS) wurde von Pierce, Thermo-Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL) erworben. Wenn nicht anders angegeben, sind alle anderen Reagenzien für die biochemische Methoden verwendet wurden von Sigma-Aldrich gekauft. LC / MS Grad ACN und LC / MS-Wasser wurden aus Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA) erworben.

2.2. Zebrafisch-Probenvorbereitung

Tabelle 1: Übersicht über die verschiedenen Lysepuffer und die Anzahl von Proteinen identifiziert unter Verwendung von 1D-LC-MS / MS-Analyse shotgun.

2.3. 1D SDS-PAGE-Vergleich von Zebrabärbling Lebertumor Proteome Heraus Verwendung verschiedene Puffer

2.4. Lebertumor Proteome In-Lösung Verdauung

2.5. Beispielbereinigung vor LC-MS / MS

2.6. Protein Identifizierung und Quantifizierung

2.7. Gene Ontology und Pathway-Analyse

Die identifizierten Proteine ​​wurden zum Gen-Ontologie (GO) -Analyse unter Verwendung von Software-Werkzeug für die schnelle Annotation von Proteinen (Bügel) v1.5.0.0 [19]. Die Pfadanalyse wurde mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software v21249400 (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die Zahlen erzeugt wurden aus IPA abstrahiert.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. 1D SDS-PAGE zeigte eine bessere Proteinextraktion Efficiency mit SDS und DOC

Im Anschluss an die Proteinextraktion aus der Leber Tumorgewebe geerntet, um die verschiedenen Extraktionspuffer verwendet, 1D SDS-PAGE-Analyse wurde durchgeführt, eine anfängliche optische Anzeige der Proteinextraktionswirkungsgrad bereitzustellen. den DOC-Extraktionspuffer war möglicherweise besser als die anderen Extraktionspuffer, wie aus der größeren Anzahl von Proteinbanden sowie höhere Intensität Banden in dem DOC-extrahierte Protein Lysatproben wie in Abbildung 1 gezeigt Proteinextraktion. Unsere Ergebnisse waren vergleichbar mit einer früheren Studie von Proc et al. [23], die das nachweislich sowohl SDS und DOC überlegenere Denaturierungsmittel Harnstoff ist als im Hinblick auf die größere Menge an solubilisierten menschlichen Plasmaproteine ​​waren. Dies könnte die größere Anzahl von Proteinbanden in den Lebertumorproben extrahierten mit SDS oder DOC erklären. Jedoch in Extraktionspuffer wie RIPA TUTS und die Konzentration von SDS und DOC könnte zu niedrig sein, um vergleichbare Ergebnisse mit denen von SDS oder DOC Extraktionspuffer zu erhalten.

Abbildung 1: CBB gefärbtes Gel aus der 1D-SDS-PAGE von Proteinen aus Lebertumorproben unter Verwendung verschiedene Extraktionspuffer extrahieren. Die Beladungskonzentration jeder Probe spiegelt die Menge an Proteinen, die aus der Leber Proben vor Trypsinverdau extrahiert. Größere Anzahl von Proteinbanden würde bedeuten größere Anzahl von Proteinen extrahiert. Dunklere Proteinbanden aus jeder Spur extrahiert würden bedeuten, eine höhere Menge an Proteinen. Schwarze Kästchen zeigen die beiden besten Extraktionspuffer und Bedingungen in Bezug auf der Anzahl von Proteinbanden und der Intensität der CBB-Färbung. Die markierten Bereiche für Spuren 2 und 7 zeigen eine größere Anzahl von sichtbaren Banden im Vergleich zu anderen Bahnen. # X394 ;: Hitze.

Darüber hinaus tastet die Zugabe des hitze Denaturierungsschritt in unserem Protokoll stark erhöht die Extraktionseffizienz in SDS-extrahiert sowie DOC-extrahiert, wie in Abbildung 1 gezeigt. Im Gegensatz dazu Denaturieren die Einführung des Wärme Schritt Proc et al. [23] zeigte keinen signifikanten Anstieg der Verdauung Effizienz der menschlichen Plasmaproteine. Unsere Beobachtungen über die Menge an Proteinen direkt aus einem Gewebe, anstatt die Verdauung Effizienz von Trypsin untersuchte die von den Autoren extrahieren beruhten. Zusätzlich wurden auf dem gesamten Gewebe unserer Ergebnisse durch Lebertumor und nicht nur Plasmaproteine. Daher könnte die Zugabe von Hitzedenaturierungsschritt stark die Menge an Proteinen in unserer Studie extrahierten verbessern. Daher angegeben unsere Ergebnisse die Notwendigkeit, die Hitzedenaturierungsschritt umfassen die Proteinextraktionseffizienz von dem gesamten Gewebe zu verbessern.

3.2. 1D LC-MS / MS-Analyse von Shotgun SDS- und DOC-Heraus Liver Tumorproben

Abbildung 2: Ein Vergleich zwischen den identifizierten Proteinen aus SDS-hitze- und DOC-Wärme-extrahierten Proben. Insgesamt 1.024 einzigartige Proteine ​​wurden von 1D-Schrotflinte-Analyse identifiziert.

Obwohl kein direkter Vergleich des Profils 1D shotgun zwischen SDS # x394; X und DOC # x394; X Proben Lebertumorgewebe wurden in der Literatur, eine Studie von Zhou et al. [24] auf der Bewertung der Anwendung von SDS in der Proteom-Analyse von Rattenhippocampusplasmamembran hat gezeigt, dass die Verwendung von DOC in einer größeren, obwohl unbedeutenden geführt hat, die Anzahl der Gesamtplasma identifizierten Membranproteine ​​oder Membranassoziierten Proteine ​​als die SDS-Methode. Unsere Ergebnisse zeigten auch einen Unterschied in der Gesamtzahl der Proteine ​​zwischen SDS # x394 identifiziert; X und DOC # x394; X-Proben, wobei letztere eine wesentlich größere Anzahl von Proteinen identifiziert hat.

Um zu bestimmen, ob verschiedene Proteine, die aus den beiden Gruppen identifiziert hinsichtlich ihrer subzellulären Lokalisation unterscheiden, führten wir eine GO-Analyse der Proteine, die D. rerio GOSLIM Datenbank. Im GO-Analyse von # x394 SDS; X und DOC # x394; (; und 25 # x25; bzw. .; 3 20 # x25) X-Proben, die Mehrheit der Proteine ​​im Zytoplasma gefunden. Die subzelluläre Lokalisierung Profile beiden Proben beobachtet, sehr ähnlich sein, aber die zusätzlichen Proteine ​​aus der DOC # x394 identifiziert; X-Proben führten zu gleichmäßigeren Verteilung des Proteins in den verschiedenen subzellulären Orten, auch Proteine ​​im Endosom zu erfassen, die nicht vorhanden ist aus der SDS # x394; X Probe. Unsere Ergebnisse hervorgehoben die Vergleichbarkeit von DOC- und SDS-basierter Extraktionsmethode in ihrer Proteom Abdeckung.

Abbildung 3: subzelluläre Lokalisierung der identifizierten Proteine ​​auf GO Analyse. (A) 881 identifizierten Proteine ​​in DOC # x394; X-Proben; (B) 659 identifizierten Proteine ​​in SDS # x394; X Proben erzeugen Gurt. Die identifizierten subzelluläre Lokalisierung Profile sind weitgehend ähnlich zwischen den beiden Proben, mit nur dem DOC # x394; X Proben Proteine ​​im Endosom angeordnet ist. Die größere Anzahl von Proteinen aus der DOC # x394 identifiziert; X-Proben zeigten auch eine gleichmäßigere Verteilung von Proteinen in allen subzellulären Orten. Prozentangaben sind auf die nächste ganze Zahl gerundet.

3.3. 2D-LC-MS / MS Shotgun Analyse von DOC-Herauslebertumorprobe

Da die DOC-Extraktionspuffer konnten mehr Proteine ​​aus dem Zellkern und verschiedene Organellen gegenüber den SDS-Extraktionspuffern extrahieren, könnte dies die Proteom Abdeckung der gesamten Zebrabärbling Leber erhöht möglicherweise die DOC-Extraktionspuffer verwendet wird. Um die Abdeckung des gesamten Proteoms für die Lebertumoren zu erhöhen, führten wir eine 2D-LC-MS / MS-Schrotflinte (2D Schrotflinte) Analyse auf der DOC # x394; X-Probe, da unsere 1D shotgun Analyse eine bessere Proteom Abdeckung mit DOC Extraktion ergab, Puffer.

Abbildung 4: Verteilung von Proteinen aus dem 2D-shotgun Datensatz von DOC-extrahierten Lebertumorproben, bezogen auf (a) subzelluläre Lokalisierung identifiziert; (B) biologische Prozesse; (C) molekulare Funktionen. Insgesamt 4.790 Proteine ​​wurden in dieser Analyse unter Verwendung von GO GURT verwendet. Prozentangaben sind auf die nächste ganze Zahl gerundet.

Die Gruppierung des 2D-Schrotflinte-Datensatz angezeigt, dass die identifizierten Proteine ​​wurden auch in verschiedenen subzellulären Standorten vertreten, wodurch die Möglichkeit von subzellulären Ort biasness entlassen. Wie dargestellt in Figur 4 (a). die identifizierten Proteine ​​wurden aus verschiedenen subzellulären Orten stammen, vor allem aus dem Kern (17 # x25;), Mitochondrien (8 # x25;) und die verschiedenen Organellen. Insbesondere das Vorhandensein von Plasmamembranproteinen (4 # x25;) unterstützt im 2D shotgun-Datensatz die frühere Studie über die Wirksamkeit von DOC in der Extraktion von schlechter wasserlöslichen Proteinen, wie Plasmamembranproteine ​​von Zhou et al. [24]. Dies liefert eine weitere Unterstützung bei der Verwendung von DOC zur Gewebeentnahme von Leber und anderen Organen.

Aus unserer GO-Analyse für biologische Prozesse, identifizierten wir Proteine ​​hauptsächlich in zellulären Prozess beteiligt ist (40 # x25;), die Verordnung (19 # x25;), Entwicklungsprozess (9 # x25;) und Lokalisierung (8 # x25 ;; 4 (b)). Unsere GO-Analyse für molekulare Funktionen identifizierten Proteine ​​hauptsächlich mit katalytischer Aktivität (44 # x25;) und Bindungsfunktionen (42 # x25 ;; 4 (c)). Aus unserer GO-Analyse haben wir die Leistungsfähigkeit unserer DOC-basierten Protein-Extraktionsverfahren zur Erzeugung Proteom-Daten zeigten, Bereitstellung einer Plattform, die Proteinextraktion aus verschiedenen Organen für die Untersuchung von Krankheiten über proteomische Ansätze zu ermöglichen.

3.4. Identifizierung von Proteinen beteiligt in wichtigen Signalweg von Leberkrebs

Abbildung 5: Die Hauptwege in den molekularen Mechanismen der Krebsentstehung beteiligt sind, wie von Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Datenbank angepasst. Die markierten Proteine ​​in gelb zeigen unsere identifizierten Proteine ​​aus unserer 2D-LC-MS / MS-Analyse. Insgesamt 77-Proteine ​​aus dem identifizierten Datensatz aus dem 2D-LC-MS / MS wird mit den molekularen Mechanismen von Krebs in Verbindung gebracht.

Abbildung 6: Der PI3K / Akt / mTOR-Signalweg ab Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Datenbank angepasst. Die markierten Proteine ​​in gelb zeigen unsere identifizierten Proteine ​​aus unserer 2D-LC-MS / MS-Analyse. Insgesamt 79 Proteine ​​aus unserem identifizierten Datensatz aus unserem 2D-LC-MS / MS sind mit diesem Weg verbunden.

3.5. Überblick über die Stärken von DOC in Proteinextraktion aus Gewebeproben

Unsere Studie demonstriert die Durchführbarkeit der DOC in der Gewinnung von Proteinen aus Zebrabärbling Lebertumorgewebe verwendet wird. Abbildung 7 stellt einen allgemeinen Überblick über die Vorteile der Verwendung von DOC als Extraktionspuffer für die Proteom-Studien. DOC ist ein kostengünstiges und weit verbreitet Denaturierungsmittel. Darüber hinaus seine Säure Unlöslichkeit und Ausfällung bei niedrigem pH-Wert ermöglichen, seine Entfernung aus der Probe vor dem LC-MS / MS-Analyse [24]. Dies ist eine der wichtigsten Funktionen über den häufiger verwendeten SDS. SDS ist unmöglich, durch Umkehrphasen-Hochleistungs-LC entfernt werden, und Spurenmenge von SDS (# X3C; 0,01 # x25;) wird die Trennung von Peptiden mit LC stören [33. 34]. Außerdem unterdrückt die Ionisation in SDS Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation und Elektrospray-Ionisation MS nähert [23], was den Verlust des Signals, die möglicherweise in dem Nieder Vertrauen Nachweis von Proteinen führen konnten.

Abbildung 7: Eine Übersicht der Vorteile der DOC als Puffer Proteinextraktion für Proteomanalyse.

Ein weiterer Schlüssel eine große Abdeckung von Proteinen in einer Proteom Profilierung Studie ist die vollständige Verdauung der Proteine ​​in Peptide zu erhalten. Somit behindert jede chemische oder Lösungsmittel, die die Aktivität des Enzyms (üblicherweise Trypsin) verwendet in reduzierter enzymatischer Digestion und Peptidnummern führen würde. Die reduzierte Menge an Peptide zu einem reduzierten Erfassungsergebnis und damit die Identifizierung des Proteins beeinflusst werden. Allerdings ist die Aktivität von Trypsin weitgehend unbeeinflusst durch eine hohe Konzentration von DOC-Lösung, sogar bis zu 10 # x25; DOC [16]. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung einer höheren Konzentration des Denaturierungsmittels in DOC solubilisierende diese schwer zu solubilisieren Proteinen zu unterstützen.

Darüber hinaus erleichtert der pH-Wert von 8 für DOC auch Trypsinverdaus ohne die Notwendigkeit, den pH-Wert neu zu justieren. Darüber hinaus ist es auch mit iTRAQ Ansatz kompatibel, die bei weitem die am häufigsten verwendeten quantitativen Proteomik Profilierungs Ansatz. Der pH-Wert für iTRAQ Markierung wird optimal bei pH 8. Daher durchgeführt, wird der pH-Wert nicht vor iTRAQ Kennzeichnung angepasst werden müssen, um die Menge an Arbeit sowie mögliche parallele Probenverarbeitungsvariationen erforderlich reduziert wird. Interessanterweise haben iTRAQ-basierte Proteomik-Studien einen pH-Reduktionsschritt, bevor die Probe auf SCX Anwendung. Daher könnte die Verringerung des pH-Wertes bei der Fällung von DOC führen, damit ihre Entfernung.

Die Zugabe von Wärme, die während der Verarbeitung der DOC # x394; X Probe verbesserte weiter die Proteinextraktionseffizienz von DOC, wie in unserer früheren Sitzung hervorgehoben. Wärme wurde nicht Extraktionspuffer angelegt, die Harnstoff, weil Wärme Harnstoff brechen kann Isocyanat zu, die Carbamylierung von Proteinen führen kann [35]. Zusätzlich Erhitzen der Proteinproben kann die Proteinaggregation ohne das Vorhandensein von Additiven, wie Detergentien [36] induzieren. Somit könnte Wärmeproteinaggregation in den anderen Lysepuffern induziert die geringe Konzentration an Detergentien und Denaturierungsmittel enthalten. Jedoch verhindert die hohe Konzentration an Waschmitteln in unserem SDS und DOC-Extraktionspuffer potentielle Proteinaggregation mit der Zugabe von Wärme zu unserem Protein-Extraktionsschritt, das weiterhin die Stärke unserer DOC-Wärme-Extraktionsverfahren Hervorhebung.

4. Schlussfolgerung

Interessenkonflikt

Jigang Wang und Yew Mun Lee gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Anerkennungen

Forschung von Zhiyuan Gong wurde von National Medical Research Council von Singapur unterstützt. Die LC / MS-Arbeiten wurden in dem Protein und Proteomics-Center, National University of Singapore durchgeführt.

Referenzen