Identifizierung, Analyse und Sequenzierung klonierter DNA - Molecular Cell Biology - NCBI Bücherregal

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Molecular Cell Biology. 4. Auflage.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al.

Angenommen, Sie ein bestimmtes Protein isoliert und wollen das Gen isolieren, die es kodiert. Eine vollständige genomische # X003bb; Bibliothek von Säugetieren enthält mindestens eine Million verschiedene Klone; eine cDNA-Bibliothek müssen so viele Klone enthalten die Sequenzen von knapp mRNAs enthalten. Wie werden spezifische Klone von Interesse an solchen großen Sammlungen identifiziert? Die gebräuchlichste Methode beinhaltet mit radioaktiv markierter DNA oder RNA-Sonden, die eine Bibliothek durch Hybridisierungs-Screening. In einem alternativen Verfahren wird ein bestimmte Klon in einer Bibliothek geklonter DNA wird auf einer Eigenschaft des kodierten Proteins identifiziert basiert.

Das vollständigste Charakterisierung einer geklonten DNA erfordert Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz; aus dieser Sequenz kann die Aminosäuresequenz eines kodierten Proteins abgeleitet werden. Die Sequenz der genomischen DNA umfasst Introns als auch Exons; es enthält auch Regionen, die die Genexpression steuern, indem die Art der Zelle bestimmen, in denen das kodierte Protein exprimiert wird, wird die Stufe in der Entwicklung sich ausdrückte, und die Menge an Protein produziert. Genomische DNAs sind: Replikationsursprünge und Sequenzen, wichtig bei der Bestimmung, wie die DNA mit assoziierten Proteinen in Chromosomen. In den folgenden Kapiteln betrachten wir, wie DNA-Sequenzen Zellen für diese Funktionen verwenden. In diesem Abschnitt werden Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung und schließlich die DNA-Sequenzierung geklont werden umrissen.

Bibliotheken können über Membran-Hybridisierungsassay Abgeschirmte

Membran-Hybridisierungstest zum Nachweis von Nukleinsäuren. Dieser Assay kann verwendet werden, sowohl DNA als auch RNA, und die radioaktiv markierte komplementäre Sonde zum Nachweis kann entweder DNA oder RNA sein. Siehe Text für weitere Einzelheiten.

Identifizierung eines spezifischen Klon von einem # X003bb; Phagen-Bibliothek mit Membran-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde. Die Position des Signals auf dem Autoradiogramm identifiziert die gewünschte Plaque auf der Platte. In der Praxis wird in der anfänglichen Plattierung aus einer Bibliothek (mehr.)

Das Auftreten einer Stelle auf dem Autoradiogramm zeigt die Anwesenheit eines rekombinanten # X003bb; Klon DNA komplementär zu der Sonde enthält. Die Position des Flecks auf dem Autoradiogramm entspricht der Position auf dem ursprünglichen Petrischale, wo diese bestimmte Klon, der ein Plaque gebildet. Da die ursprüngliche Petrischale noch viele infektiöse Virionen in jedem Plaque enthält, können Viruspartikel aus dem identifizierten Klon für replating durch Ausrichten des Autoradiogramm und die Petrischale und Entfernen von Viruspartikeln aus dem Klon entsprechend der Stelle wiedergewonnen werden. Eine ähnliche Technik kann zum Screenen einer Plasmidbibliothek in E. coli-Zellen eingesetzt werden.

Oligonukleotidsonden basieren auf Teilproteinsequenzen Entwickelt

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Herstellung von Oligonukleotidsonden. Im Allgemeinen wird eine radiomarkierten Oligonucleotid-Sonde verwendet, um ein zu screenen # X003bb; cDNA-Bibliothek, die Membran -Hybridisierung Technik. Sobald ein cDNA Klon, der ein bestimmtes Protein kodiert, erhalten wird, kann die Volllängen-cDNA radiomarkierten verwendet werden, um eine genomische Bibliothek auf Klone zu sondieren, die Fragmente des Gens, codierend das Protein enthält.

degenerierte Sonden

Ein Verfahren zur Herstellung einer spezifischen Sonde vorbereitet ist in Abbildung 7-19 skizziert. Das gereinigte Protein von Interesse wird verdaut mit einem oder mehreren Proteasen (zB Trypsin) in spezifische Peptide und die N-terminalen Aminosäuresequenzen von einigen dieser Peptide werden durch sequentiellen Edman-Abbau oder Massenspektrometrie bestimmt (siehe Abbildungen 3-46 und 3-47). Basierend auf dem genetischen Code. Die Oligonukleotid-Sequenzen, die die ermittelten Peptidsequenzen codiert, kann vorhergesagt werden. Recall jedoch, dass der genetische Code degeneriert ist; das heißt, viele Aminosäuren durch mehrere Codons codiert (siehe Tabelle 4-2). Da die spezifischen Codons das Protein von Interesse unbekannt sind zu kodieren verwendet, Oligonukleotide alle möglichen Kombinationen von Codons enthalten, müssen synthetisiert werden, um sicherzustellen, dass einer von ihnen wird perfekt das Gen entsprechen.

Designing Oligonucleotidsonden basierend auf Proteinsequenz. Ein isoliertes Protein ist, mit einem selektiven Protease, wie Trypsin, verdaut, welches spezifisch spalten Peptidbindungen auf der carboxyterminalen Seite von Lysin und Argininresten. Die sich ergebende (mehr.)

Eine Mischung aller Oligonukleotide, die einen ausgewählten Teil einer Peptidsequenz kodieren kann, wird eine degenerierte Sonde genannt. Eine solche Mischung kann durch Zugabe von mehr als ein Nukleotid Vorläufer der Synthese-Reaktion an den Stellen, in der Sequenz zu einer Zeit hergestellt werden, die durch alternative Basen codiert werden können. Der letzte Schritt diese Art der Sonde, die in Vorbereitung ist den Oligonukleotide radioaktiv zu markieren, in der Regel durch eine 32 P-markierte Phosphatgruppe von ATP auf den 5 # x02032 übertragen; Ende jeden Oligonucleotids unter Verwendung von Polynucleotidkinase (Abbildung 7-20). Screening von a # X003bb; cDNA-Bibliothek mit einer degenerierten Sonde, die die Membran -Hybridisierung Technik verwendet werden Klone identifiziert, die in der Sondenmischung auf den perfekt komplementären Oligonukleotid hybridisieren. Unter den üblichen experimentellen Bedingungen auch Oligonukleotide, die hybridisieren an einer oder zwei Basen von der cDNA-Sequenz unterscheiden.

Die radioaktive Markierung eines Oligonukleotids an der 5 # x02032; und mit Phosphor-32. Die drei Phosphatgruppen in ATP bezeichnet sind das # X003b1 ;, # X003b2 ;, und # X003b3; Phosphate in der Reihenfolge ihrer Position von dem Ribosering von Adenosin entfernt (Ad). ATP enthält (mehr.)

Einzigartige EST-Based Probes

Computerprogramme, die den genetischen Code gelten, werden verwendet, um die EST-Sequenzen in Teil Protein Aminosäuresequenzen zu übersetzen. Mit Programmen, die für den Zweck und einen Personal Computer entwickelt wurden, kann ein Forscher die aktuelle EST-Datenbank für eine EST suchen, die untersuchen eine bestimmte partielle Aminosäuresequenz in dem speziellen Protein kodiert. Wenn eine Übereinstimmung gefunden wird, dann stellt die EST die einzigartige DNA-Sequenz von dem Teil des Volllängen-cDNA. Eine einzelne, spezifische Sonde bis # X02248; 100 Basen lang ist, dass perfekt komplementär zu einem Abschnitt des EST kann dann synthetisiert und radioaktiv markiert werden. Alternativ kann die Polymerase-Kettenreaktion. am Ende des Kapitels beschrieben ist, kann eine Sonde, die gleich der gesamten Länge des EST zu synthetisieren, verwendet werden. Inzwischen ist die menschliche EST-Datenbank so groß, dass ESTs identifiziert werden kann, die teilweise Aminosäuresequenzen, die von den meist isolierten humanen Proteinen bestimmt kodieren.

Spezifische Klone identifiziert werden Basierend auf Eigenschaften der kodierten Proteine

Genomische und cDNA-Bibliotheken können auch für die Eigenschaften eines bestimmten Proteins in den DNA geklonten codierten gescreent werden. Dieser Ansatz nutzt spezielle Klonierungsvektoren, genannt # X003bb; Expressionsvektoren. in dem die geklonte DNA in mRNA transkribiert, die wiederum in das codierte Protein translatiert. Beispielsweise, # X003bb; Phagenvektoren wurden so konstruiert, dass die Verbindung der eingefügten DNA liegt in einer Region des Vektors, die transkribiert wird, und bei einer hohen Rate umgerechnet. Geklonte DNA an dieser Position eingeführt wird, in jeder Zelle, die durch diesen Typ von Vektor infiziert in mRNA transkribiert. Falls das klonierte DNA mit einer Protein-kodierenden Sequenz in dem gleichen Leserahmen wie das Vektor-Protein eingefügt enthält, werden infizierten Zellen ein Fusionsprotein herzustellen, bei dem der Aminoterminus durch den Vektor-DNA und der Rest des Moleküls durch die klonierte DNA kodiert wird ( Abbildung 7-21).

Gebrauch von # X003bb; Expressionsklonierung eines klonierten DNA auf die Bindung des kodierten Proteins mit einem spezifischen Antikörper basiert zu identifizieren. Das # X003bb; gt11-Vektor wurde entwickelt, um das E. coli-Protein zu exprimieren # X003b2; -Galactosidase auf hohem Niveau. Der einzige Eco RI (mehr).

Wenn Nitrocellulose-Filter replica werden aus einer rekombinanten Bibliothek in einem konstruierten hergestellt # X003bb; Expressionsvektor. Fusionsproteine ​​von jedem einzelnen Klon exprimiert werden, an das Nitrocellulosefilter gebunden. Die Replika-Filter kann eine Detektion spezifischer Fusionsproteine ​​durch Verfahren gescreent werden. Zum Beispiel kann ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch für ein Protein von Interesse mit Replika-Filter von einem inkubiert werden # X003bb; cDNAExpressionsbibliothek. Wenn einer der # X003bb; Klone exprimiert ein Fusionsprotein, das die Region des Proteins, das durch diesen monoklonalen Antikörper, Antikörpermoleküle an der Position dieses spezifischen Klons an den Filter binden gebunden enthält. Nach dem Waschen des Filters um ungebundene Antikörper zu entfernen, wird die Position des spezifischen Klon wird durch Inkubation mit einem zweiten, radioaktiv markierten Antikörper nachgewiesen, der den ersten Antikörper erkennt, durch Autoradiographie des Filters folgte.

Bei diesem Verfahren bezeichnet Expressionsclonierung. jedes Molekül, das an ein Protein von Interesse mit hohen Affinität und Spezifität bindet, kann als Sonde markiert und verwendet werden, um Klone zu identifizieren, das interagierenden Protein exprimieren. Zum Beispiel hat bei der Identifizierung Expressionsklonierung cDNA-Klone, die Proteine ​​codieren nützlich gewesen, die an spezifische DNA-Sequenzen binden; viele solche Proteine ​​sind bei der Kontrolle der Transkription beteiligt. In diesem Fall wird eine markierte synthetische doppelsträngige DNA-Sonde mit Replika-Filter inkubiert, aus einer cDNA-Bibliothek in ein kloniertes zubereitet # X003bb; Expressionsvektor. Bindung des markierten DNA durch Fusionsproteine, lokalisiert die Positionen von gewünschter Klone auf dem ursprünglichen Filter. Wie in einem späteren Abschnitt beschrieben ist, können auch andere Arten von Expressionsvektoren verwendet werden, um große Mengen eines Proteins aus einem klonierten Gens herzustellen.

Gelelektrophorese Resolves DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe

Sobald ein spezifischer DNA-Klon isoliert worden ist, wird der klonierte DNA aus dem Vektor-DNA durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym getrennt verwendet, um das rekombinante Plasmid zu bilden. wie oben beschrieben. Die klonierte DNA und Vektor-DNA werden dann durch Gelelektrophorese getrennt. ein leistungsfähiges Verfahren für Proteine ​​(Kapitel 3) der Größe nach zu trennen. Die Gelelektrophorese ist auch zur Trennung von DNA und RNA-Moleküle nach Größe und zur Abschätzung der Größe von Nucleinsäuremolekülen unbekannter Länge durch Vergleich mit der Wanderung von Molekülen bekannter Länge verwendet.

Die Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge durch Gelelektrophorese. Ein Gel wird hergestellt, indem eine Flüssigkeitsgießeinrichtung entweder geschmolzener Agarose oder Acrylamid unpolymerisierten zwischen zwei Glasplatten wenige Millimeter auseinander enthält. Da die Agarose erstarrt oder (mehr).

Zwei Verfahren sind häufig zur Sichtbarmachung getrennt DNA-Banden auf einem Gel. Wenn die DNA radiomarkiert ist nicht, wird das Gel in einer Lösung inkubiert, um den Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid enthält:

Diese planare Molekül bindet sich an DNA, die durch zwischen den Basenpaaren interkalieren. Bindungs ​​Konzentrate Ethidium in der DNA und erhöht auch seine intrinsische Fluoreszenz. Als Ergebnis, wenn das Gel mit ultraviolettem Licht beleuchtet wird, fluoresziert die Bereiche der DNA-Gel mit mehr viel heller als die Regionen des Gels, ohne DNA (Abbildung 7-23a).

Visualisierung der Beschränkung durch Gelelektrophorese getrennt Fragmente. (A) mehr verschiedene Plasmid-Klone wurde mit EcoRI verdaut und die verdaute DNA wurde unterzogen, um Agarosegelelektrophorese die klonierten Fragmente aus dem Plasmid zu trennen (mehr.)

Radioaktiv markierte DNA kann durch Autoradiographie des Gels sichtbar gemacht werden. In diesem Fall wird das Gel gegen ein Blatt von photographischem Film im Dunkel gelegt, um den Film an den Stellen, wo aussetzt markierter DNA vorhanden ist. Wenn der Film entwickelt wird, wird ein photographisches Bild der DNA beobachtet (7-23b). Radiolabeled DNA-Banden können auch durch die Verlegung des Gels gegen einen Phosphorimager-Schirm erkannt werden, der zählt, # X003b2; Teilchen, die durch markierte Moleküle in dem Gel freigesetzt. Die resultierenden Daten werden von einem Computer gespeichert und können in ein Bild des Gels umgewandelt werden, die ähnlich wie ein Autoradiogramm aussieht.

Puls-Feld-Gel-Elektrophorese Trennt große DNA-Moleküle

Wenn ein elektrisches Feld auf große DNA-Moleküle in einem Gel angewendet wird, wandern die Moleküle in der Richtung des Feldes und auch in Längsrichtung strecken. Wenn der Strom dann gestoppt wird, beginnen die Moleküle # X0201c; entspannen # x0201d; in Zufallsknäuel. Die Zeit für die Erholung erforderlich ist, um die Länge eines Moleküls direkt proportional. Das elektrische Feld wird dann bei 90 # x000b0 erneut angewandt; oder 180 # x000b0; zu der ersten Richtung. Längere Moleküle entspannen weniger als kürzere während der Zeit der Strom ausgeschaltet wird. Da die Moleküle in eine Zufallsknäuel entspannen müssen, bevor sie in eine neue Richtung Anfahren, mehr Moleküle in der Richtung, die durch das neue Feld langsamer als kürzere auferlegte Bewegung setzen. Wiederholter Wechsel von der Feldrichtung zwingt allmählich großes DNA-Molekül unterschiedlicher Größe immer weiter auseinander.

Pulsfeld-Gel-elektrophoretische Trennung von großen DNA-Molekülen. Spur 1 zeigt einzelnes DNA-Molekül; Jede Bande stellt ein Chromosom aus der Hefe S. cerevisiae. Spur 3 zeigt NotI-Restriktionsfragmente des E. coli-Chromosoms, das war (mehr.)

Gereinigtes DNA-Moleküle können schnell durch zwei Verfahren sequenzierenden

Praktisch alle Informationen, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus erforderlich sind, in der DNA seines Genoms codiert wird. Die Verfügbarkeit von Techniken zur Herstellung und separate DNA-Restriktionsfragmente ein paar hundert Nukleotiden führten lange zur Entwicklung von zwei Verfahren für die genaue Nukleotidsequenz von DNA-Abschnitten Bestimmung von bis zu # X02248; 500 Nukleotide lang. Diese DNA-Sequenzierungsverfahren, zusammen mit der Technologie für eine Bibliothek Konstruktion des gesamte Genom eines Organismus darstellt, machen es möglich, die genaue Sequenz des gesamten DNA des Organismus zu bestimmen.

Maxam-Gilbert-Verfahren

In den späten 1970er Jahren entwickelt, A. M. Maxam und W. Gilbert Das erste Verfahren zur Sequenzierung von DNA-Fragmenten, enthaltend bis zu # X02248; 500 Nukleotide. Bei diesem Verfahren werden vier Proben eines endmarkierten DNA-Restriktionsfragments werden bei unterschiedlichen spezifischen Nukleotiden chemisch gespalten. Die resultierenden Subfragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt. und die markierten Fragmente werden durch Autoradiographie nachgewiesen. Wie in 7-27 gezeigt. die Sequenz des ursprünglichen endmarkierten Restriktionsfragment kann direkt aus parallel Elektrophoretogramme der vier Proben bestimmt werden.

Maxam-Gilbert-Verfahren zur Sequenzierung von DNA-Fragmenten von bis zu # X02248; 500 Nukleotide in der Länge. Das doppelsträngige Fragment wird an dem 5 # x02032 markierten sequenziert; mit 32 P endet (siehe Abbildung 7-20). Das Etikett (roter Kreis) wird von einem Ende entfernt wird, und (mehr.)

Sanger (Dideoxy) Methode

Einige Jahre später, F. Sanger und seine Kollegen ein zweites Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, die jetzt viel häufiger als das Maxam-Gilbert-Verfahren verwendet wird. , 3 # x02032;; -dideoxynucleoside triphosphate (ddNTPs), die fehlt ein 3 # x02032; -Hydroxylgruppe (Abbildung 7-28), um das Sanger-Verfahren wird auch Didesoxysequenzierung weil es umfasst die Verwendung von 2 # x02032 genannt. Bei diesem Verfahren wird der Einzelstrang-DNA dient zur in vitro DNA-Synthese als Matrizenstrang sequenziert; ein synthetischer 5 # x02032; -Ende-markierter Oligodesoxynucleotid wird als Primer verwendet.

Strukturen von Ribonucleosidtriphosphat (NTP), Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) und Didesoxyribonukleosid Triphosphat (ddNTP).

Wie in 7-29 gezeigt ist. vier getrennte Polymerisationsreaktionen sind jeweils mit einer niedrigen Konzentration von einem der vier ddNTPs zusätzlich zu höheren Konzentrationen der normalen Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) durchgeführt wird,. In jeder Reaktion wird das ddNTP zufällig an den Positionen des entsprechenden dNTP eingebaut ist; solche Zugabe eines ddNTP beendet Polymerisation wegen der Abwesenheit eines 3 # x02032; Hydroxyl verhindert Zugabe des nächsten Nukleotids. Die Mischung der terminierten Fragmenten aus jeder der vier Reaktionen wird die Elektrophorese parallel zu-Gel unterzogen; die getrennten Fragmente werden dann durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Sequenz des ursprünglichen DNA-Matrizenstrang kann direkt aus dem resultierenden Autoradiogramm gelesen wird (Abbildung 7-29c sehen). Sobald die Sequenz, die für ein bestimmtes Fragment klonierte DNA bestimmt wird, Primer für überlappende Fragmente chemisch dieser Sequenz basierend auf synthetisiert werden kann. Die Sequenz einer langen kontinuierlichen Strecke von DNA kann also durch individuell bestimmt werden Sequenzieren der überlappenden klonierten DNA-Fragmente, die sie zusammensetzen.

Sanger (dideoxy) Verfahren zur Sequenzierung von DNA-Fragmenten. (A) ein Einzelstrang der DNA sequenziert (blaue Linie) werden soll, wird zu einem 5 # x02032 hybridisiert, synthetischem Desoxyribonucleotid-Primer -End-markiert. Der Primer wird in vier getrennten Reaktionsmischungen verlängert (mehr.)