in einem menschlichen 3D Lungengewebe Modellsystem Staphylokokken-Pneumonie Modellierung abgrenzt Toxin-vermittelte

1 Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Zentrum für Infektionsmedizin, S-141 86 Stockholm, Schweden

2 CIRI, Internationales Zentrum für Infektiologie Forschung, INSERM, U1111, CNRS UMR5308, Universit # x000e9; Lyon 1, # X000c9; cole Normale Sup # x000e9; rieure de Lyon, 69008 Lyon, Frankreich

3 Französisch Nationales Referenzzentrum für Staphylokokken, Hospices Civils de Lyon, 69677 Bron Cedex, Frankreich

4 Abteilung für Mikrobiologie, Moyne Institut für Präventivmedizin, Trinity College, Dublin 2, Irland

* Diese Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit

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SCHLüSSELWöRTER: Staphylococcus aureus. Pneumonia, 3D-Lungengewebe Modell

EINFÜHRUNG

TRANSLATIONAL IMPACT

Durch Belichtung isoliert die 3D menschlichen Lungengewebe auf bestimmte S. aureus Exotoxine durch klinische Pneumonie produziert, zeigt diese Studie, dass ein hohes Maß an # X003b1; Toxins direkt das Lungenepithel schädigen und dass PVL trägt zur Gewebeverletzung indirekt durch die Lyse von Neutrophilen. Darüber hinaus zeigte die Studie, dass die schwerste Gewebepathologie durch die Kombination von hohen Konzentrationen beide hervorgerufen wird # X003b1; Toxins und PVL. In ähnlicher Weise offenbarte eine Sammlung von klinischen S. aureus-Stämmen von Personen mit Lungenentzündung, dass tödlicher Ausgang zu hohen Toxinproduktion und hohe Zytotoxizität verbunden ist. In Ergänzung, # X003b1; Toxins und PVL induzierte Entzündungen und starke Hochregulation von Chemokinen, anschließend erhöhte Neutrophilenmigration verursacht. Bemerkenswert ist, sowohl # X003b1; -toxin- und PVL-vermittelten cytotoxischen Wirkungen und Gewebeschäden wurden durch Anwendung von polyklonalen intravenösem Immunglobulin (IVIG) bei physiologischer Konzentration vollständig außer Kraft gesetzt.

Auswirkungen und zukünftige Richtungen

Höhere Zytotoxizität und erhöhte Gewebepathologie durch Toxine ausgelöst sezerniert durch Pneumonie Isolaten nekrotisierende

Klinische S. aureus-Isolaten und Plasmide, die in dieser Studie verwendet

Bakterienüberstand-vermittelte Zytotoxizität und Epithelgewebe Verletzung. (A, B) Die Zytotoxizität wurde durch Messungen LDH in den Überständen von Neutrophilen (A) und Lungenepithelzellen (16HBE) (B) hergestellten Bakterienüberständen ausgesetzt beurteilt bestimmt.

# X003b1; Toxins stört direkt das Epithel im Lungengewebe Modelle

Um zu untersuchen, ob eine unterschiedliche Expression des # X003b1; Toxins Rezeptor könnte ADAM10 erklären die unterschiedliche Anfälligkeit für # X003b1;-Toxin-vermittelte Zytolyse, die Oberflächenexpression von ADAM10 auf Lungenepithelzellen, Lungenfibroblasten und Neutrophilen wurde mit Durchflusszytometrie analysiert. In Übereinstimmung mit der Empfindlichkeit von verschiedenen Zelltypen wurde die höchste Expression von ADAM10 mit Lungenepithelzellen gesehen, gefolgt von Fibroblasten, Neutrophilen, während das niedrigsten Niveau exprimiert (Abb # x000a0;. 2 F). Im Lungengewebe wurde ADAM10 reichlich exprimiert und in Übereinstimmung mit dem Durchflusszytometrie Daten, höhere Expression wurde in der geschichteten Epithelschicht festgestellt als in der stromalen Fibroblasten-Schicht (Fig # x000a0;. 2 G).

PVL trägt indirekt zu Lungenepithelzellen Schäden durch neutrophile vermittelte Zytotoxizität

PVL trägt zur Lungenepithelzellen Schäden durch neutrophile Granulozyten vermittelten Zytotoxizität. (A) Histologische Schweres Scoring von Modellen Lungengewebe zu Kulturüberständen von LE2332 oder NP753 ausgesetzt, unbehandeltem Neutrophilen (PMN) und / oder LE2332 lichtete PMN. Das .

S. aureus Toxine Gewebsnekrose induzieren, erhöhte Entzündung und Chemokin-Reaktionen im Lungengewebe Modelle

Entzündliche und Chemokin-Reaktionen, die durch Staphylokokken-Kulturüberständen und reine Toxine ausgelöst. Lungengewebemodelle zu Kulturüberständen von NP796 ausgesetzt, NP753, LE2332, USA300 oder reinen Toxinen wurden geschnitten und immunhistochemisch gefärbt.

Um weiter zu untersuchen, wie diese Migration von Neutrophilen beeinflusst, testeten wir die Kulturmedien aus stimulierten Lungengewebe Modelle in einem Transwell-Migrationstest geerntet. Wie dargestellt in Fig # x000a0;. 4 G, Medien von S. aureus -exposed Gewebemodelle neutrophilen Migration induziert, die der des positiven Kontroll überschritten wird, und die höchsten Reaktionen wurden mit Bakterienüberstände von den Isolaten nekrotisierender Pneumonie gesehen. Auch Überstände aus beiden PVL- und # X003b1;-Toxin-behandelten Lungengewebemodelle stimuliert eine starke chemotaktische Reaktion über einen breiten Konzentrationsbereich und in einem größeren Ausmaß als die positive Kontrolle (Fig # x000a0;. 4 H).

# X003b1; Toxins und PVL Produktion von klinischen S. aureus-Isolaten Pneumonie beziehen sich auf Zytotoxizität und dem klinischen Ergebnis

Zusammengenommen legen die Daten nahe, dass die schwerste Gewebepathologie durch die kombinierte Wirkung hervorgerufen wird von # X003b1; Toxins und PVL. Um dies zu testen in einem klinischen Material, analysierten wir eine Sammlung von 31 CA Pneumonie-Stämmen (Tabelle # x000a0; S2) für die Toxinproduktion und Zytotoxizität. Eine positive Korrelation zwischen # X003b1; Toxins Ebenen und Cytotoxizität gegen Lungenepithelzellen (P # X0003c; 0,0001) festgestellt wurde, während die Ebenen PVL korrelierte mit Cytotoxizität gegen Neutrophilen (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 A). In exponierten Lungengewebe Modellen wurde Schädigung wesentlich mit Ebenen korreliert von # X003b1;-Toxins, die in den bakteriellen Überständen (P # X0003c; 0,006) (Fig # x000a0;. 5 B). In ähnlicher Weise Schäden, insbesondere korreliert neutrophil-vermittelten epithelialen mit Stämmen exprimieren hohe Niveaus von PVL (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 C). Dividieren der Stämme nach dem klinischen Ergebnis ergab, dass die Stämme von nicht-überlebenden höhere Zytotoxizität gegen Lungenepithelzellen ausgelöst (P # X0003c; 0,05) und Neutrophilen (P # X0003c; 0,05) als Stämme von Überlebenden (Fig # x000a0;. 5 D). Hohe Zytotoxizität gegenüber beiden Epithelzellen und Neutrophilen war signifikant häufiger (50% gegenüber 10%) bei den mit tödlichem Ausgang Stämmen (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 E). Analyse von # X003b1; Toxins und PVL durch Stämme von Nicht-Überlebenden und Hinter erzeugten Ebenen zeigten signifikant höheren PVL in Stämmen von Nicht-Überlebenden und eine Tendenz zu höheren # X003b1; Toxins (Abb. # X000a0; 5 F).

Toxins Ebene und zytotoxische Aktivität in den Überständen von ambulant erworbenen (CA) Lungenentzündung isoliert. Eine Sammlung von CA-Pneumonie-Isolaten (n = 31) wurde für den Toxingehalt und zytotoxische Aktivität in Bakterienkulturüberständen analysiert. (A) Die Korrelation der.

Toxin-vermittelte epitheliale Schädigung von IVIG blockierten

DISKUSSION

MATERIALEN UND METHODEN

Bakterienstämme

Toxins ELISAs

Zellkulturen und Stimulation Assays

Durchflusszytometrie-Analyse

Alle Zelltypen wurden mit konjugierten anti-ADAM10-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA) und im Vergleich zu ihrer Isotyp-Kontrolle gefärbt. Die Fluoreszenz wurde mittels Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung derselben Lasereinstellungen für alle verschiedenen Zelltypen nachgewiesen.

3D Lungengewebe Modellsystem

Die histologische Analyse und Immunfärbung

Live-Darstellung von 3D-Lungengewebe Modelle

HMGB1 und CXCL8 ELISA

Die Pegel von HMGB1, CXCL8, TNF # x003b1; und IL-1 # x003b2; in Überständen von stimulierten Lungengewebe Modelle wurden unter Verwendung von humanen CXCL8 gemessen, TNF # x003b1; und IL-1 # x003b2; Quantikine ELISA (R # x00026; D Systems) und humanen HMGB1 ELISA (IBL international) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alle Proben wurden doppelt analysiert.

Transmigrations-Chemotaxistest

Western-Blot-Analyse

statistische Analyse

Anerkennungen

Wir danken Dr. Ranganathan Iyer bei Global Krankenhäuser, Hyderabad, Indien für freundlich die NP796, NP753 und LE2332 Stämme bieten. Die geschickte technische Unterstützung durch Yvonne Benito, Michele Bes, Florenz Couzon und Cedric Badiou (CIRI, Internationales Zentrum für Infektiologie Research; Inserm) gedankt. Wir sind dankbar, dass BioM # x000e9; rieux und GSK-Impfstoffe für die Antikörper für PVL erforderlich Bereitstellung und # X003b1; ELISA-Toxins, respectively. Diese Studie wurde zum Teil durchgeführt an der Live Cell Imaging Unit, Abteilung für Biowissenschaften und Ernährung, Karolinska Institutet.

SMS. FRAU. und A.N.-T. die Studie konzipiert; SMS. P. C. A.T.N.H. H. B. F. V. N. S. und I.R.M. experimentelle Ansätze entwickelt und durchgeführt werden; SMS. T.J.F. F. V. G. A. FRAU. und A.N.-T.wrote das Papier; SMS. P. C. A.T.N.H. F. V. N. S. I.R.M. T.J.F. G. A. FRAU. und A.N.-T. analysiert und interpretiert die Experimente; und G. L. F. V. G. A. und T.J.F. mitgelieferten Reagenzien und Analysetools. Alle Autoren haben gelesen und das fertige Manuskript genehmigt.

Die Studie wurde durch Zuschüsse aus dem Karolinska Institutet unterstützt (AN-T.), Stockholm County Council (MSAN-T.), Europäische Kommission (FP7-Health 305340-2), Swedish Research Council (AN-T.), Die schwedische Forschung Links Programm (AN-T.), Knut und Alice Wallenberg-Stiftung (AN-T.) und die Science Foundation Ireland Programm Investigator gewähren 08 / IN.1 / B1845 (TJF).

Referenzen

Artikel aus Krankheitsmodelle # X0026; Mechanismen werden hier mit freundlicher Genehmigung von Unternehmen von Biologen zur Verfügung gestellt