Klonierung und molekulare Analyse von Genen

Das Ergebnis eines Experiments, das mit Klonierung Gesamt-DNA aus einer bestimmten Quelle beginnt, ist eine Bibliothek von Klonen. Somit mRNA Klonieren durch eine cDNA Zwischen erzeugt eine cDNA-Bibliothek, die die mRNA von dieser spezifischen Entwicklungsstufe darstellt. Im Gegensatz dazu, wenn Sie gesamten menschlichen DNA beispielsweise in einen Lambda- oder Cosmid-Vektor zu klonen, erhalten Sie eine genomische Bibliothek, die (mit einer Wahrscheinlichkeit von 95-99%) enthält alle Sequenzen aus dem menschlichen Genom oder DNA-Komplement. Lambda oder Cosmidbibliotheken wird in der Regel für Genombibliotheken verwendet, da Sie in der Regel ein ganzes Gen, das sowohl die kodierende Sequenz und regulatorische Elemente auf einem einzigen Klon klonen.

Eines der Schlüsselelemente benötigt, um ein Gen während der Klonierung zu identifizieren, ist eine Sonde. Eine Sonde ist normalerweise eine klonierte DNA-Stück, das einen Teil der Sequenz enthält, für die sie suchen. Sie werden in der Regel die Sonde radioaktiv machen und es zu einer Lösung hinzuzufügen. Filter immobilisierte Klone enthalten, werden dann in die Lösung getaucht. Der Haupt hinter diesem Schritt ist, dass die Sonde an jedem Klon binden Sequenzen ähnlich denen auf der Sonde gefunden enthält. Dieser Bindungsschritt wird die Hybridisierung genannt.

• Probe - eine Nukleinsäure (gewöhnlich DNA), die zu einem spezifischen Gen oder ein Nukleinsäure-Sequenz von Interesse komplementär ist; Wenn eine cDNA-Bibliothek ist, kann ein Antikörper gescreent wird, verwendet werden, um das Protein zu identifizieren, die von dem Insert des Klons exprimiert werden
• Homologe Probe - eine Sonde, die genau komplementär zu der Nukleinsäuresequenz ist, für die sie suchen; Ex. eine menschliche cDNA verwendet, um eine menschliche genomische Bibliothek suchen
• Heterologe Probe - eine Sonde, die ähnlich ist, aber nicht genau komplementär zu der Nukleinsäuresequenz, für die sie suchen; Ex. eine Maus-Sonde verwendet, um eine menschliche genomische Bibliothek suchen

Screening einer cDNA oder genomischen Bibliothek

1. immobilisieren Mitglieder der Bibliothek auf eine Nylonmembran und denaturiert, so dass sie einzelsträngig sind
2. Vorbereitung eines radioaktiv markierten Sonde und denaturieren sie es einsträngige machen
3. die Sonde mit der Bibliothek von Clonen hybridisierte
4. Waschen Sie die überschüssige Sonde und belichten, um ein Röntgenfilm
5. den positiven Klon isolieren und analysieren,

Der Hybridisierungsschritt wird bei einer nicht-stringenten Temperatur durchgeführt, die die Sonde gewährleistet in jedem Klon binden wird eine ähnliche Sequenz enthält. Zur gleichen Zeit werden einige nicht-spezifische Hybridisierung auftreten, da einige der Klone beschränkt enthalten, aber keine signifikante Ähnlichkeit mit der Sonde. Der Waschschritt wird bei einer Temperatur durchgeführt stringent, die hoch genug ist, um die Sonde zu waschen alle Klonen mit dem es in einer unspezifischen Weise gebunden hat. Aber es ist wichtig, dass die Temperatur nicht so hoch ist, dass es die Sonde aus der Klone wäscht, die Sequenzen enthalten, die auf die Sonde selbst ähnlich oder identisch sind. Daher Überlegung über die Quelle der Sonde (homologe oder heterologer) bestimmt die Temperatur, bei der der Waschschritt durchgeführt wird.