PNAS, Mobil
Um zu bestimmen, ob die dominant-negative Strategie verwendet werden könnte, TGF-β-vermittelter Wachstumsinhibierung in vivo zu blockieren. wir haben die Überexpression von ΔβRII von transgenen Mäusen auf die Epidermis ausgerichtet. Mice ΔβRII weisen einen verdickten und faltige Haut exprimieren, die in Homozygoten Mobilität und führt zu perinatale Letalität einschränkt. Diese Studie belegt die Rolle des Typ-II-TGF-β-Rezeptors in vivo in Wachstumshemmung der Epidermis zu vermitteln. und weiter betont die Bedeutung der TGF-β-Signalwegs in Aufrechterhaltung der Homöostase der Epidermis.
MATERIALEN UND METHODEN
Erzeugung und Identifizierung von ML.ΔβRII transgenen Mäusen.
Herstellung und Analyse von RNA.
Die Gesamt-RNA wurde aus neonatalen Epidermis mit RNAzol B (Tel-Test Friendswood, TX), wie beschrieben (13) isoliert. Um die Expressionsniveaus des ML.ΔβRII Transgen zu bestimmen, RNase-Schutztests wurden durchgeführt, ein RPA II-Kit (Ambion, Austin, TX) und einen 32 P-markierten Ribosonde spezifisch für ΔβRII. Um jede RNA-Probe für die Unterschiede in der Beladung zu normalisieren, ein 32 P-markierte Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Ribosonde wurde in jeder Analyse einbezogen. Zu vergleichen, wurde ML Transgen-Expressionsniveaus mit der des endogenen ML-Gens, einem 32 P-markierten Ribosonde entsprechend 200 bp über beide 3 'nicht-kodierenden Sequenzen kodierenden und des nativen ML-Gens synthetisiert. Die gesamte 200-bp-Sonde auf native ML Transkripte geglüht, aber nur 150 bp der Sonde an Transkripte des ML Transgen geglüht. Die Intensität der geschützten Bande wurde durch Scannen von densitometeric Röntgenfilmen bestimmt.
Western-Blot-Analyse.
Die Epidermis von transgenen oder Kontrolle littermates wurde von der Dermis (13) getrennt sind, und die Gesamt epidermalen Protein wurde wie beschrieben extrahiert (14). Eine gleiche Menge an Protein aus jeder Probe wurde durch Elektrophorese auf einem 12,5% SDS / PAGE-Gel und auf einen Nitrocellulose-Membran getrennt. Western-Blot-Analyse wurde wie beschrieben durchgeführt (15) unter Verwendung von 10 & mgr; g / ml eines Maus-mAb gegen den menschlichen c-myc-Epitop (Oncogene Science) und ein ECL-Western-Blotting-Detektionssystem (Amersham).
Gewebe Histologie.
BrdUrd Uptake und Färbung.
Immunofluoreszenz.
Zellkultur und [3 H] Thymidin (TdR) Incorporation.
Die Expression der Transgene ML.ΔβRII in der Epidermis.
Um die Expression des ΔβRII (8) auf die Epidermis Target, verwendeten wir ein verkürztes ML-Promotor, der Transgene in beiden basalen und suprabasalen Schichten der Epidermis exprimiert. Der Aufbau und die Charakterisierung dieses Vektors wurden beschrieben (19). Fig. 1 A ist eine schematische dieses Vektors, enthaltend die ΔβRII Mutante (ML.ΔβRII). Drei transgenen Linien, B9223, B9273 und C1072 wurden als Transgen Expressoren durch RNase-Schutz-Analyse bestätigt. Das ML.ΔβRII Transgen wurde auf einem sehr hohen Niveau-d.h ausgedrückt. 4- bis 5-fach gegenüber der des GAPDH-Gens in transgenen Epidermis (Fig. 1 B links). Um die Expressionsniveaus von ML.ΔβRII mit dem dem endogenen ML-Gen, eine Sonde zu vergleichen, die sowohl die endogenen (200 bp) und Transgen (150 bp) Transkripte wurde erkennt verwendet. Man beachte, dass transgene Expressionsniveaus sind etwa 50% von derjenigen des endogenen Loricrin Gens (Fig. 1 B rechts). Western-Blot-Analyse, die einen Antikörper gegen den humanen c-myc-Tag verwendet wird, detektiert, um ein prädiziert ΔβRII Molekül von 23 kDa in Extrakten von transgenen, nicht aber steuern, Epidermis (Fig. 1 C). Die Expression des ML.ΔβRII Transgen, wie es bei den beiden RNA und Protein-Ebene bestimmt, wobei die Schwere jeder Zeile phänotypischen korreliert (siehe unten).
ML.ΔβRII Transgene Mäuse zeigen eine hyperplastische / Hyperkeratotisch Haut Phänotyps.
Erhöhte Labeling Index.
Zur Bestimmung der Proliferationsrate von ML.ΔβRII epidermis relativ zu Kontrollen, F1 littermates mit BrdUrd bei 24 Stunden nach der Geburt gekennzeichnet. In normalen Epidermis wurden Basalzellen mit BrdUrd mit einer Rate von 36 ± 8,3 Kernen / mm (Fig. 2 G) markiert, wohingegen in der Epidermis ML.ΔβRII BrdUrd Kennzeichnung auf 92 ± 2,1 Kerne / mm erhöht wurde (Fig. 2 H) . Obwohl die meisten der Markierung in Basalzellen ML.ΔβRII Epidermis aufgetreten ist, wurden einige suprabasalen Zellen ebenfalls markiert (Abb. 2 H). Somit bestätigen diese Daten, sowohl eine erhöhte Proliferationsrate und eine Aufweitung des proliferativen Kompartiment in ML.ΔβRII Epidermis.