Wie Hintergrundbeleuchtung in Hellfeldmikroskopie ImageJ Dokumentation Wiki korrigieren

Dieser Abschnitt erläutert Methoden Hintergrundbeleuchtung Korrektur in Hellfeldmikroskopie zu tun.

Hintergrundkorrektur angewendet werden kann, während die Bilder zu erwerben (a priori) oder nach der Übernahme (a posteriori). Der Unterschied zwischen diesem ist, dass a priori-Korrektur zum Zeitpunkt der Bilderfassung erhaltenen Bilder zusätzlich verwendet, während in der a posteriori-Korrektur, die zusätzlichen Bilder nicht verfügbar sind und daher ein ideales Beleuchtungsmodell ist davon auszugehen. Die a-priori-Verfahren sind daher die bevorzugte Option.

Wenn Bilder dort Digitalisierung gibt mehrere Quellen von Bildverschlechterung zu berücksichtigen:

Zufallsrauschen. Dies ist auf unkorrelierte Schwankungen oberhalb und unterhalb der Bilddaten als eine Folge der Art der Bildsensoren. Diese Schwankungen mit der Zeit variieren (so unterscheiden sie sich von Schuss zu Schuss), und sie kann durch eine Mittelung mehrerer aufeinanderfolgender Bilder reduziert werden (unter der Annahme, dass die Probe nicht bewegt, und dass es keine Vibration der Ausrüstung). Jedoch Bildmittelungs neigt dazu, das Bild (das heißt einige Verwischung mit Schärfeverlust) zu erweichen. Der Betrag der Rauschunterdrückung durch Mittelung erreicht wird, ist proportional zur Quadratwurzel der Anzahl der Bilder. Dies bedeutet, dass das Geräusch zu reduzieren, um die Hälfte eines 4-Bilder mitteln muss; zu reduzieren, muss es auf ein Viertel der ursprünglichen 16 Bilder mitteln, und so weiter.

Festmusterrauschen ( „hot Pixel“) wird von Pixelintensitäten charakterisiert, die durchweg über Zufallsrauschschwankungen sind und es aufgrund von fehlerhaften oder CCD Pixeldifferenzen in Ladungsleckrate (dies wird auch als „elektronischer bias“ des Sensors bezeichnet). FPN wird deutlich, wenn lange Belichtungszeiten (zum Beispiel in der Fluoreszenzmikroskopie) und erhält mehr akzentuiert mit höheren Temperaturen (das heißt, warum manche Kameras gekühlt werden). Die „Hot Pixel“ erscheinen als hellen Pixel im Bild immer in der gleichen Position in Aufnahmen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Diese können die durch Subtraktion der sogenannten „Dunkelfeld“ kompensiert werden (ein Schuss mit dem Lichtpfad behindert, aufgenommen mit den gleichen Einstellungen wie der normale Schuss, siehe unten).

Die Intensität der Hintergrundbeleuchtung durch die Mikroskoplichtquelle Optik vorgesehen ist meist nicht homogen im gesamten Sichtfeld (die Mikroskopkondensor always „Flachfeld“ -Beleuchtung nicht vorgesehen, es ist üblich, einen hellen Fleck in der Mitte des Feldes zu haben).

Stellen Sie sicher, dass Ihre Lichtquelle ein Infrarotfilter (manchmal auch als „Wärme Filter“ genannt).

Schalten Sie die Kamera Auto-Gain (oder automatische Belichtung). Wenn Ihre Kamera die Autoverstärkungsfunktion nicht ausschalten kann (wie in den meisten Webcams), das hier beschriebene Verfahren wird nicht funktionieren. Ebenso, wenn eine Standard-Fotokamera verwenden, muss man es in dem manuellen Modus setzen, so dass alle nachfolgenden Aufnahmen mit genau den gleichen Belichtungseinstellungen getroffen werden.

Setzen Sie die Probe auf der Bühne, das Objekt fokussieren, stellen Sie den Hell- / Neutralfilter und Kühler, stellt eine geeignete Belichtungszeit der Kamera.

Wenn die Kamera eine Weißabgleich-Funktion hat, gilt es nun auf dem leere beleuchtete Hellfeld: zuerst die Probe herausnimmt und dann den Weißabgleich an.

Überprüfen Sie das Histogramm des Hellfeld um sicherzustellen, dass es nicht gesättigt ist und nicht zu dunkel. Bei Bedarf neu justieren das Licht entsprechend (oder einfügen / entfernen Sie einige Neutraldichtefilter) und gelten weiß wieder ausgleicht.

Neupositionierung der Probe und erneut prüfen, dass das Bildhistogramm (zu viele Pixel an den schwarzen oder weißen Extremen) nicht gesättigt ist, und daß die Grauwerte überspannen die meisten der Graustufen-Raum (d.h. den Dynamikbereich maximieren). Von nun an sollten die Einstellungen der Kamera und das Mikroskoplicht nicht mehr eingestellt werden.

Blockieren den Lichtpfad (nicht das Mikroskoplicht auszuschalten. Die meisten Mikroskope haben einen Hebel, der Benutzer den Lichtweg zu dem Verlängerungsrohr läßt blockieren, wo die Kamera ist), und einen Schuß zu erfassen. Dieses Bild wird überall fast schwarz sein, mit Ausnahme der „Hot Pixel“, wenn irgendwelche (manchmal Hotpixel sind nicht sehr auffällig, aber sie können in dem Histogramm des Bildes überprüft werden). Speichern Sie das Bild als „Dunkelfeld“ der verwendet wird, für Hot-Pixel zu kompensieren.

Öffnen Sie nun den Lichtweg, entfernen Sie die Probe (das Bild ist alles, Hintergrund) und einen Schuss erfassen. Speichern Sie es als „Hellfeld“; es wird die Hintergrundbeleuchtung zu kompensieren.

Legen Sie die Probe auf der Bühne und erfassen einen Schuss. Speichern Sie es als „Specimen“.

Der Betrieb (in einem 8-Bit-Kanal) besteht, die Durchlässigkeit durch die Probe zu berechnen:

Zuerst werden wir die elektronische bias (hot Pixel) in dem Hellfeld und Probenbildern kompensieren.

Mit dem Befehl Prozess> ImageCalculator. berechnen (Hellfeld - Dunkelfeld), und rufen Sie das Ergebnis „Divisor“:

Machen Sie dasselbe mit dem Probenbild: (Specimen - Dunkelfeld) und nennen das Ergebnis „Zähler“.

Als nächstes berechnen wir die Durchlässigkeit als das Verhältnis von durchgelassenem Licht durch die Probe und das einfallende Licht des korrigierte Bild zu erzeugen. Das heißt, die Aufteilung der Bilder: Numerator / Divisor.

Das Ergebnis dieser Division ist eine reelle Zahl zwischen 0 und 1 (0, wenn kein Licht überhaupt durch die Probe verläuft, 1, wenn die gesamte einfallendes Licht durch die Probe strömt). Diese Nummer kann nicht in einem 8-Bit pro Kanal Bild gespeichert werden; stattdessen wird der Wert neu skaliert auf den Bereich von 0-255 pro Kanal durch das Divisionsergebnis multipliziert mit 255. Das in einem einzigen Schritt mit dem Calculator_Plus Plugin erreicht wird, die die Unterteilung durchführt, gefolgt durch eine Multiplikation (und eine Summe, wenn nötig in double precision) alle vor dem eingeklipst Ergebnis zurück in ein Bild einzufügen:

Das Ergebnis sollte eine flache (auch) Hintergrund haben, der weiß oder neutral (es sei denn, der Glasobjektträger hat einen merklichen Tönung) erscheinen sollten, solange Sie nicht alle Einstellungen der Kamera zwischen den Aufnahmen verändert hat (Zeit, Belichtung, Weiß Balance, etc.) oder die Mikroskopeinstellungen (Licht, Kondensator, Vergrößerung).

Man kann, indem durchschnittliche Schüsse und nicht einzelne das Signal / Rausch-Verhältnis verbessern. In diesem Fall ist das Dunkelfeld, Hellfeld und Specimen Bilder können als der Durchschnitt von mehreren Schüssen erzeugt werden. Wenn die Kamera oder der Erwerb von Software nicht für durchschnittliche Erfassung ermöglicht, kann man nacheinander die Bilder erfassen (das IJ_Robot Plugin kann nützlich sein, dies zu automatisieren), sie dann zu einem Stapel konvertieren und schließlich Z-Projekt des Stapel der mittlere Intensität Option . Zum Beispiel, um durchschnittlich 16 Schüsse, 16 Bilder packen und dann laufen:

Das Ergebnis „ZProjection von Stack“ ist das gemittelte Bild.

Weitere Schüsse in den gleichen Bedingungen. nehmen ein neues Probenbild (offensichtlich) und Wiederverwendung Divisor und Dunkelfeld.

Änderungen der Vergrößerung und / oder Mikroskop-Beleuchtung. Nehmen Sie eine neue Probe (natürlich), ein neues Brightield Bild und eine Neuberechnung der Divisor Bild (Sie können die Wiederverwendung des Dunkelfeld).

Änderungen in den Kameraeinstellungen. nehmen alle wieder Bilder.

Verschiedene Verfahren wurden aus einem einzigen Bild die Eigenschaften des Hintergrunds zu extrahieren vorgeschlagen. Beispielsweise:

Paßt ein Polynom Oberfläche bis zu einer Anzahl von Abtastpunkten (das keine Probe enthält) in dem Bild und die Verwendung dieses als Hellfeldbild für die Korrektur wie oben. Mindestens 4 Plugins implementieren dieses Prinzip:

Ein Plugin von Bob Dougherty ist auch für den Einbau Legendre Polynome verfügbar (Polynomial_Fit. Sie haben Subtraktion der angepassten Oberfläche zu implementieren),

Ein Plugin von Michael Schmid (Fit Polynomial). Dies hat den Vorteil der Schwelle unter Verwendung der Bereiche des Bildes, auszuwählen, um die angepasste Oberfläche zu versehen und subtrahieren, falls gewünscht.

Ein Plugin von Cory Quammen (Ungleichmäßige Hintergrundentfernung) findet ein kleinsten Quadrate von Hintergrundproben innerhalb des Bildes auf einem von zwei Intensitätsprofilen: eine Ebene oder einem kubischen Polynom 2D.

Verwenden ein morphologisches Verfahren, wie die „Rollkugel“ -Algorithmus [Sternberg S. Biomedical Image Processing, IEEE Computer 1983; 16 (1): 22-34]. Dies wurde in ImageJ als Prozess> Subtract Background umgesetzt. Dieses Verfahren stellt einige Bildartefakte.

Allerdings sollte man sich bewusst sein, dass alle retrospektiven Methoden Annahmen über die Bildeigenschaften machen, die streng erfüllt in jedem beliebigen Bild unwahrscheinlich sein sollen. Zum Beispiel ist es nicht möglich, konsequent eine diffuse dunkle Flecken aufgrund der Anwesenheit von Flecken von einem aufgrund ungleichmäßiger Hintergrundbeleuchtung zu unterscheiden. Es ist immer besser, die Bilder mit einer a priori Methode zu korrigieren.

Mit nur 1 Bild, ist es schwierig zu wissen, was Lärm ist und was Bildtextur. Man kann die Bildglättung versuchen (zB Gauß-Faltung), aber dies wirkt sich auch auf die Kantenschärfe. Medianfilterung ist besser an Kanten erhalten, sondern wirkt sich nach wie vor das Bild mit einem gewissen Verlust an Detail.

Mit nur 1 Bild verfügbar ist, ist eine mögliche Lösung nur die heißen Pixel mit dem Mittelwert seiner Nachbarn zu ersetzen, ohne den Rest der Pixel gemittelt werden.
Unten ist ein Makro, das diese Idee implementiert. Beachten Sie, dass die Pixel nicht geclustert werden, und sie sollten gesättigt sein [Wert = 255 in 8-Bit-Graustufen-Bilder oder alle in 8-Bit-Kanäle der RGB-Bilder]. Wenn die heißen Pixel, die nicht gesättigt sind, können Sie Schwelle sie (was die heißen Pixel = 255 und die restlichen Pixel = 0 und das Hinzufügen dieses schwellen Bild auf dem Original (dies wird die heißen Pixel sättigen) .Wenn es gibt weiße Bereiche, die nicht brauchen Entrauschen, kann man zunächst 1 auf das gesamte Bild subtrahieren und dann sättigt die Pixel (so die heißen Pixel haben einen Wert von 255 und die weißen Bereiche 254).