Biuret-Protein-Assay

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Spektralphotometer Video

Auch wenn Sie bereits ein Spectrawave sichtbares Licht-Spektralphotometer verwendet haben, sollte das Video bewerten helfen Sie mit der heutigen Arbeit, wie es itseslf auf dem Protein-Test wertvolle Informationen liefert.

Einführung

Offensichtlich verstehen die Strukturen und Funktionen von Enzymen, Organellen, Zellen, Gewebe, Organe und Organsysteme wir die Strukturen und Funktionen einzelner Proteine ​​untersuchen müssen. Ein Ausgangspunkt zu einer solchen Studie ist es zu wissen, wie viel Protein wir haben. Der häufigste Ansatz zur Bestimmung, wie viel Protein wir in einer Probe haben, ist ein kolorimetrischer Test zur Durchführung der Proteinkonzentration zu bestimmen. In einem kolorimetrischen Assay wird eine Proteinprobe mit einem Reagenz gemischt, das Farbe in der Gegenwart von Protein ändert, wobei die Farbintensität proportional zur Konzentration des Proteins in der Probe.

Die Biuret-Protein-Assay wurde als ein Verfahren veröffentlicht Proteinkonzentration in den 1940er Jahren, um zu bestimmen, obwohl die Reaktion selbst als Anfang des 19. Jahrhunderts vor, so lange untersucht. Die Biuret-Assay wurde häufig in die 1980er Jahre eingesetzt und ist immer noch in Gebrauch, weil es so bequem und kostengünstig herzustellen und einfach zu bedienen. Wenn wir eine Proteinprobe Assay verlieren wir davon einige, weil das kolorimetrische Reagens, das Protein in dem Prozess zerstört. Da der Biuret-Assay viel Protein vielen Labors verbraucht verwenden Methoden, die eine viel empfindlichere Farbreagenz wie dem Bradford-Test verwenden. Wir verwenden den Biuret-Test für diese Laborstudie, weil Sie Ihre eigene Reagenz aus anorganischen Reagenzien vorbereiten können (das heißt von „Scratch“), erhalten Ihnen eine Möglichkeit zu geben, Ihre Lösung-Kompetenzen zu üben.

Vorbereitung

Neben der Überprüfung und dieses Protokolls Druck ab, prüfen Sie bitte die Online-Ressource auf Mischungen und Lösungen, und den Videoclip der WPA S1200 Spectrawave Spektrophotometer zur Verwendung. Sie müssen auch Teil A des Protokolls (siehe unten) beenden.

experimentelle Überblick

Heute werden Sie Ihre Lösung machen Fähigkeiten üben durch eine komplexe Lösung (Biuret Reagenz) vorbereitet. Wir haben auch erfahren Sie mit einem Spektralphotometer zu kalibrieren, und wir werden Sie Ihre Lösung mit Kalibrierungsstandards, die Rinderserumalbumin (BSA) haben testen.

  • Bereiten Biuret Farbreagenz
  • In Farbreagenz zu einem Referenzrohr und zwei Kalibrierungsstandards, das Protein
  • Kalibrieren eines Spektrometers
  • Lesen und Aufzeichnen Absorptionswerte

*** Sie müssen Augenschutz in diesem Labor Sitzung tragen ***

A) Bereiten Biuret Farbreagenz

Teile 1-3 sind abgeschlossen sein, bevor Labor kommen. Diese Informationen sind Teil des Protokolls, in dem Notebook aufgezeichnet werden, wie Sie die Arbeit ausführen.

  1. Lesen Sie die Formel für Biuret Reagenz sorgfältig und vollständig. Biuret Reagenz besteht aus 0,9% (W / V) Natriumkaliumtartrat, 0,3% Kupfersulfat x 5 H2O und 0,5% Kaliumiodid, die alle in 400 ml 0,2 M NaOH gelöst, um (fw 40,0), dann auf ein Endvolumen gebracht von einem Liter. Dies ist eine von mehreren Möglichkeiten, in die man könnte eine Lösung Formel beschreiben.
  2. Skalieren die Formel nach unten um ein Endvolumen von nur 200 ml Reagenz zu machen. Verkleinerung bedeutet die Formel alle Mengen und Volumina anzupassen, um ein kleineres Volumen der Lösung zu machen. Zum Beispiel, 200 ml Biuret Reagenz machen Sie nur 1,8 g Kaliumnatriumtartrat benötigt (abgespeckte von 9 g pro Liter). Die Menge 1,8 g in 200 ml in dem gleichen Verhältnis wie 0,9 g in 100 ml, was eine 0,9% ige Lösung ist.
  3. Schreiben Sie jeden Schritt nach unten, die Sie durchführen werden Ihr Reagenz herzustellen, mit dem Anfangsvolumen von Wasser und der Masse des ersten Reagens beginnen, die Sie auflösen. Schreiben Sie jeden Schritt klar und lassen nichts, auch jedes Mal, wenn Sie q.s. Volumen. HINWEIS: Alle Chemikalien einschließlich der NaOH als feste Reagenzien zur Verfügung stehen. Sie haben alles fron Kratzer vorzubereiten.

Teile 4-7 der Teil A ist im Labor abgeschlossen werden.

  1. Um eine Toplader elektronische Waage Stelle ein Stück wiegt Papier auf der Pfanne zu verwenden. Tarieren durch [Drücken des Hebels]. Abzuwiegen stellen Sie sicher, trocken chemische zuerst, dass Ihr Spachtel sauber ist. Wenn nicht, dann spülen und trocknen, bevor sie in der chemischen Glas zu erreichen. Vorsichtig trocken Chemikalie auf das Papier, bis die gewünschte Masse haben. Wenn Sie zu viel hinzufügen, dann wieder nicht den Überschuss in das Gefäß. Legen Sie es in einem Abfallkorb oder spülen Sie es in den Ausguss. Wir kehren nur einen Überschuss in das Gefäß, wenn die Sachen viel zu teuer zu verschwenden ist.
  2. Zum Lösen Sie Ihre chemischen das Wasser oder teilweise fertiggestellte Lösung rühren Sie die Rührstab mit Rührplatte mit und fügen Sie die Chemikalie direkt aus dem Papier wiegen. Schabt es in, wenn nötig. Wenn einige Materialien klebt an den Seiten des Kolbens dann eine Pasteurpipette verwenden, um es zu waschen in die Lösung nach unten.

*** Spritz / Spill Gefahr zu minimieren halten Sie den Anschlag in dem Kolben unter Rühren und Lagerung ***

  1. Um q.s. zuerst sicher, dass alle Volumen des Trockenreagens gelöst ist. Füllen Sie die Lösung in einen Zylinder des entsprechenden Volumens und dann mit deionisiertem Wasser abzurunden. Bringen Sie die Lösung in den Kolben und kurz umrühren zu mischen.
  2. Ihr ausgefülltes Reagenz sollte klar blau sein. Sobald es gemischt, dann ist die Rührplatte auszuschalten.

B) Bereiten Sie eine Referenz und zwei Kalibrierstandards

Um die Qualität Ihrer Biuret Reagenz zu überprüfen wir haben Sie eine Referenzröhre herzustellen, mit denen Ihr Spektralphotometer und zwei Kalibrierungsstandards zu kalibrieren unterschiedliche Mengen an Rinderserumalbumin.

C) Bereiten Sie Ihre Spektralphotometer und testen Sie Ihr Reagenz

Ihre Spektralphotometer sollte sehr wenig Aufwärmzeit benötigen.

D) Reinigen Sie Ihre Glaswaren und Arbeitsbereich bis

  • entleeren sorgfältig die Kulturröhrchen mit gebrauchter Biuret Reagenz in die nächste Senke und entsorgen sie in dem Glasabfallbehälter. Spülen Sie Verschüttetes Reagenz aus Ihrem peg Rack und senden es an der vorderen Bank
  • Spülen Sie die Zylinder und Kolben mit entionisiertem Wasser aus einem Wasserhahn und lassen sie an der Luft trocknen. Mit Wasser und Seife, und wenn eine Flaschenbürste notwendige Reagens an das Glasware stecken zu entfernen.
  • Reinigen Sie die Oberfläche Ihrer Rührplatte ab.
  • Reinigen Sie Ihre Spachtel und spülen Sie ihn mit entsalztem Wasser.
  • Abbürsten jedes Reagenz, von der Waage und von der Tischfläche verschüttet worden, der es in dem nächsten Papierkorb angeordnet wird.
  • Spülen Sie die serologische Pipette durch die Erstellung und expeling entsalztem Wasser ein paar Mal. Lassen Sie es und die pipet Hilfe auf der Bank - sie wiederverwendbar sind.
  • Begradigen Sie die Arbeitsfläche nach oben, so dass es wie Sie es gefunden.

Die Planung des Protein Assay

  • Überprüfen Sie die Powerpoint-Präsentation auf Assays. auch auf Owlspace als druckbare Kopie (111_assays.pdf) mit Noten.
  • Überprüfen Sie die Powerpoint-Präsentation auf Verdünnungen. auch auf Owlspace als druckbare Kopie (111_dilutions.pdf) mit Noten.

Hintergrund

Die Biuret-Assay kann eine quantitative Abschätzung der Konzentration des Proteins liefern, damit wir experimentelle Ergebnisse analysieren oder ein Experiment optimieren. Es sei daran erinnert, dass Biuret Reagenz ändert sich die Farbe mit einer Intensität proportional zur Konzentration des Proteins in einer Probe (innerhalb von Grenzen). Um die Proteinkonzentration in einer Probe abzuschätzen, für die die Konzentration nicht bekannt ist, müssen wir Standards verwenden, zum Vergleich. Standards sind Proben bekannte Mengen an Protein enthält. Wenn wir Farbreagens mit den Standards mischen wir eine Reihe von Farbintensitäten erhalten, die die Unbekannten zu vergleichen.

Man könnte Proteinkonzentration von Unbekannten schätzen, indem jeden unbekannt mit dem Satz von Standards zu vergleichen, aber das Verfahren hat offensichtliche Nachteile. Es stützt sich auf unser Urteil und natürlich gibt es was zu tun ist, wenn die Farbänderung eines unbekannten zwischen den Farbwechsel von zwei Standards fällt. Zuletzt haben wir Ihnen ein Gerät ein Spektrophotometer genannt. die umwandelt Farbänderung zu einer Menge eines Absorptionswert bezeichnet. Durch die Messung der Absorption Werte auf eine Reihe von Protein-Standards entsprechen, können wir eine Standardkurve der Absorption gegen die Menge an Protein plotten. Absorptions- und Menge an Protein sind kontinuierliche Variablen, also sollten wir eine Trendlinie, die Absorption der gesamten nutzbaren Bereich des Assays betragen über bezieht sich hinzuzufügen.

Wir können von seiner Absorption in einem unbekannten die Menge des Proteins abzuschätzen, indem die entsprechende Menge aus der Standardkurve zu lesen. Konzentration der unbekannten ist einfach die geschätzte Menge durch das Volumen der Probe dividiert, die in das Röhrchen gegeben wurden.

Vorbereitung

Sie müssen Ihre Standardkurve voraus planen.

experimentelle Überblick

Heute werden Sie durch die Durchführung eines Protein-Tests starten. Wir haben Sie die Standardkurve in Ihrem Notebook vorbereiten, in der Klasse, und es verwenden, Proteinkonzentrationen für zwei Unbekannten zu schätzen. Wir werden dann haben Sie die Informationen verwenden, um die Arten von Zielen zu erreichen, die ein Teil von vielen Laborprotokollen sind.

  • Bereiten Sie eine Reihe von Protein-Standards, fügen Farbreagenz, bestimmen Extinktionen
  • Bereiten Unbekannten für einen Assay, fügen Farbreagens und Messen Extinktionen
  • Plot um eine Standardkurve in Ihrem Notebook und fügen Linie einen Trend
  • Schätzung Konzentrationen für Ihre Unbekannten
  • Berechnen Sie, wie Ihre Unbekannten verdünnen mit zwei unterschiedlichen Ansätzen
  • Schätzung Fraktionsausbeuten für zwei Unbekannten

*** Sie müssen Augenschutz in diesem Labor Sitzung tragen ***

Bereiten A) Proteinstandards

  1. Unter Bezugnahme auf die Tabelle in Schritt 3 unten, die Berechnung das Volumens von 20 mg / ml Proteinstandard in jedes Teströhrchen zu gehen.
  2. Wir wollen das Volumen auf 1 ml pro Röhrchen normalisieren, bevor Farbreagens hinzufügen. Andernfalls wird mit variablen Volumina dosiert Farbintensität beeinflussen und die Ergebnisse verfälschen. Bestimmt das Volumen von Wasser zu jedem Röhrchen hinzugefügt, so dass das Ausgangsvolumen jeden Rohrs 1 ml ist. Bringen Sie diese Zahlen Labor mit Ihnen
  3. Unter dem Titel „Protein-Standards“, eine Tabelle in Ihrem Notebook, wie im Beispiel unten aufgebaut. Füllen Sie die beiden Volumen Spalten mit den Werten, die Sie vor dem Labor berechnet. Lassen Sie die Absorption Spalte leer für jetzt.

Menge Protein (mg)

Volumen 20 mg / ml BSA (ml)

Volumen Wasser (ml)

In B) Farbreagenz, brüten, lesen und notieren Sie die Absorptionswerte

  1. Wenn Sie bereit sind, verwenden Sie eine serologische Pipette 5 ml Farbreagenz zur Referenzrohr hinzuzufügen und zu jedem Ihrer Standards.
  2. Während Ihre Rohre an der Bank (10 Minuten) werden inkubiert, einschalten und kalibrieren Spektrophotometer, wie Sie das letzte Mal gelernt. Das Referenzrohr erfordert nicht die 10 Minuten Inkubation ..
  3. In der Reihenfolge, in der Farbe Reagenz zugegeben, lesen und die Absorption (nicht Lässigkeit) aufnehmen zu jedem Ihrer Standards entspricht. Für die besten Ergebnisse Absorption Farbreagenz und Lesen des Zeitintervall sollte die Nähe für jedes Rohr auf das gleiche zwischen Zugabe.
  4. Halten Sie Ihre Referenzröhre erneut überprüfen Sie Ihre Kalibrierung, wenn Sie Ihre Unbekannten lesen.

C) vorbereiten Unbekannten und lesen Extinktionswerte

Sie müssen Unbekannten zum Vergleich mit den Standards vorzubereiten. Natürlich sollten Sie alle Informationen in Ihrem Notebook aufzeichnen, wie Sie gehen.

Wir bereiten zwei Röhren für jeden unbekannten so, dass, wenn ein Rohr zu viel oder zu wenig Protein enthält, gemessen werden, die andere Röhre uns eine brauchbare Lektüre geben soll.

  1. Pipettieren des eingebrachten Volumen unbekannter in jedes jeweiliges Rohr, durch das Volumen des eingebrachten Wassers.
  2. In Farbreagenz, brüten sie aus, überprüfen Sie Ihre Spektrophotometer Kalibrierung und Ihre Absorptionen lesen, Aufnahme in Spalte 4 Ihrer Unbekannten-Tabelle.
  3. Überprüfen Sie, ob mindestens eine Absorption für jede Ihrer Unbekannten zu lesen fällt in den Bereich der Absorptionswerte Ihrer Standards. Wenn Ihre Daten sind „gut“, dann haben Sie alle Informationen, die Sie mit dem müssen den Rest der Arbeit abgeschlossen ist, bevor Sie für den Tag verlassen.

D) Bereinigen

Bitte reinigen Sie alle Geräte und Zubehör und aufrichten Ihre Bankbereich.

Datenanalyse

Bereiten Sie Ihre Standardkurve und Schätzung Proteinkonzentrationen

Aus den Extinktionen für Ihre Unbekannten schätzen jede Proteinkonzentration. Denken Sie daran, dass die Konzentration der unbekannten die Menge an Protein, das durch das Probenvolumen geteilt verwendet wird, nicht die Gesamtmenge in dem Teströhrchen. Vereinbarungsgemäß berichten wir fast immer Proteinkonzentrationen als Milligramm / Milliliter (mg / ml). Für jeden unbekannten erinnern auch die einzelnen Absorptionswert zu verwenden, die innerhalb der meisten linearen Teil der Standardkurve fällt.

Planen Verdünnungen zu machen

Alle anzeigen Arbeit. Zuerst müssen wir Sie auf eine gewünschte endgültige Konzentration von Protein um ein bestimmtes Anfangsvolumen verdünnen. Dies ist die Art der Verdünnung, die Sie durchführen, um würde eine funktionierende Lösung zu machen. Zweitens werden Sie feststellen, wie jede Ihrer Proben in ein gewünschten endgültigen Volumen und Konzentration herzustellen.

  1. Ihr erstes Problem besteht darin, zu bestimmen, wie zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml 150 ul jeder Ihrer zwei Unbekannten zu verdünnen. Sie wissen, v1. Sie mit Ihrer c1 Standardkurve bestimmt, und die gewünschte Endkonzentration von 1 mg / ml ist c2. In Ihrem Notebook notieren Sie die drei bekannten Variablen für jedes Ihrer Unbekannten zu verwässern. Berechnen v2. zeigt alle Berechnungen in Ihrem Notebook. Schreiben sowohl v2 nach unten und die Lautstärke zu v1 hinzuzufügen.
  2. Ihr zweites Problem besteht darin, zu bestimmen, wie die jeden unbekannten zu verdünnen um ein Endvolumen von 150 & mgr; l bei einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml zu erhalten. Aufzeichnung wieder die drei bekannten Variablen und bestimmen für jeden unbekannten die unbekannte Variable. Alle Berechnungen.

Estimate Fraktionsausbeuten

Ein gemeinsames Konzept für das Lernen, wie etwas funktioniert, ist es auseinander zu nehmen. Wir wenden dieses Prinzip Gewebe zu leben, wenn wir führen, was wir eine Gewebe Fraktionierung nennen. Wir beginnen in der Regel durch das Gewebe zu homogenisieren, dann trennen wir das Homogenat in Komponenten, die oft ein Verfahren differentielle Zentrifugation genannt einsetzen. Zentrifugieren ergibt eine feste Komponente (das Pellet), die in einem Volumen von Flüssigkeit resuspendieren. Es ergibt sich auch eine flüssige Komponente, um den Überstand, dass wir weiter verarbeiten. Wenn wir eine Fraktionierung durchführen wollen wir in der Lage sein, gewonnen zu berichten, wie viel von jeder Komponente die wir haben, in der Regel in Bezug auf die Menge an Protein.

Hypothetische Fraktionsvolumina

Die folgende Tabelle listet Fraktionen und Volumina von einer hypothetischen Fraktionierung von ganzen Lebergewebe erhalten. Für den Zweck dieser Übung wird angenommen, daß jedes Ihrer zwei Unbekannten eine Probe aus der Fraktion wurde mit Etikett entspricht (z unbekannten A wurde eine Probe aus Fraktion A, etc.).

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