Die Verwendung von Dot Blots Analyse bei der Trennung von Anti-HIV-Antikörpern in Tieren, Open Access-Zeitschriften

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Forschung Artikel Open Access

Engel Alberto Justiz Vaillant 1 *. Norma McFarlane-Anderson 2. Patrick Eberechi Akpaka 1. Monica P Smikle 3. Niurka Ramirez 4
und Armando Cadiz 5

2 Abteilung für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Universität von Westindien, Mona Campus, Jamaika

3 Institut für Mikrobiologie, die Universitätsklinik von Westindien, Mona Campus, Jamaika

4 Abteilung für Innere Medizin, Freyre de Andrade Hospital, Havana Stadt, Kuba

5 Carlos J. Finlay Vaccine und Serum Institute, Havanna, Kuba

Dot-Blots Analyse; HIV Anti-gp120-Antikörper; ELISA; Trennung; Proteine; Immunisierung

Einführung

Ein Dot-Blot ist eine Technik in der Molekularbiologie verwendeten Biomoleküle zu erfassen, und zur Erfassung, Analyse und Identifizierung von Proteinen. Es stellt eine Vereinfachung des Northern Blot, Southern-Blot oder Western-Blot-Verfahren. Die Technik bietet erhebliche Einsparungen bei Zeit, wie Chromatographie oder Gelelektrophorese, und das komplexe Blot-Verfahren für das Gel ist nicht erforderlich. Er bietet jedoch keine Informationen über die Größe des Ziel-Biomoleküls [1].

Produktion von anti-HIV-Antikörpern in Tieren ist eine sichere Alternative für die Entwicklung von Reagenzien in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), Western Blot und Dot-Blots verwendet werden, verwendet, um HIV-Infektionen bei Menschen zu diagnostizieren [2]. Die Antikörper können an Enzyme und andere Moleküle unmarkierten oder markierten verwendet werden. Es ist eine Alternative zur Verwendung von humanen Antikörpern aus dem Serum von HIV-positiven Patienten aufgereinigt für die Entwicklung von Diagnose-Kits. In der vorliegenden Arbeit erzeugten wir Antikörper in 3 Tierarten: Katzen, Ratten und Hühnern und wir die Antikörper durch Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Peroxidase-markierten HIV-Proteinen Konjugat als Sonde getrennt. Der gereinigte Antikörper konnte in der Diagnose oder als neuer Weg der Therapie für HIV-Patienten verwendet werden.

Materialen und Methoden

Herstellung von HIV-Immunogene: Diese Studie, die am Biochemie-Labor der Universität von Westindien, Mona, verwendete Jamaika ein Peptidfragment von gp120 von HIV-HIV-gp120 (254-274) durchgeführt wurde: Cys-Thr-His-Gly -lle-Arg-Pro-Val-Val-Ser-Thr-Gln-Leu- Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu [3]; das wurde an Keyhole Limpet hemocynin (KLH) durch das Glutaraldehydverfahren konjugiert, wie zuvor in der Literatur beschrieben ist [4].

Entwicklung von Anti-HIV-Antikörpern bei Katzen und Ratten

Anti-gp120 positive Eier wurden ausgewachsene Katzen gefüttert, 2-3 Jahre alt (1 männlich und 4 weiblich). Jede Katze erhielt im Durchschnitt von 2 Eiern in 5 Volumina Sojamilch wöchentlich für 10 Wochen verdünnt. Vollei wurde an Ratten (2-3 ml) durch Magenintubation zugeführt werden; wöchentlich 9 Wochen und während der letzten Woche wurden sie täglich gefüttert. Serum von Katzen und Ratten wurden nach dem Fütterungsprogramm zur Bestimmung von anti-HIV-Antikörper unter Verwendung von Verfahren erhalten, die zuvor in der Literatur beschrieben worden [7].

Enzyme-linked Immunosorbent Assay zur Detektion von Anti-HIV-Antikörper (ELISA)

Die 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten (U-förmigen Boden) wurden mit 50 ng des synthetischen gp-120-Peptid in Beschichtungspuffer über Nacht bei 4 ° C beschichtet. Die Mikroplatten wurden 4X (PBS-Tween-20) gewaschen und blockiert (3% fettfreier Milch in PBS, 25 ul / Vertiefung, 1 h, RT). Die Mikroplatten wurden 4X (PBS-Tween-20) gewaschen und dreifache Ausführung von 25 ul IgY (1 mg / ml), 25 ul Seren von Katzen oder Ratten verdünnt 1.16 in PBS-non fettfreie Milch zugesetzt wurden. Nach Inkubation für 2 h bei RT wurden die Mikroplatten gewaschen 4X und 25 ul einer universellen Konjugat SpLAG-anti-IgY-HRP (bestehend aus Peroxidase-markiertem-IgY chemisch gekoppelt an Protein A, Protein G und Protein-L) [7], verdünnt 1 : 1000 wurde eine weitere 1 h bei RT zugegeben und inkubiert. Dann wurden die microplats 4X gewaschen. Nach dieser 3,3’ , wurde verwendet, 5,5'-Tetramethylbenzidin (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) Lösung (50 ul). Nach einer weiteren Inkubation von 15 min im Dunkel wurde die Reaktion gestoppt, als positive Kontrollen für die Farbentwicklung in positiven Proben und ohne Farbe in negativen Proben wurden gefärbt und untersucht. Positive Kontrollen von einem positiven Humanserum für Anti-HIV-Antikörper waren, negative Kontrollen waren von einer Schildkröte Serum (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) und Blanks 0,9% Kochsalzlösung.

Dot-Blot-Analyse auf anti-HIV-Antikörper

Kurz gesagt, 2 ul 1: 2-Verdünnungen von Huhn IgY oder 2 ul Serum von Ratten und Katzen wurden auf Nitrocellulose-Papier in einem Bio-Dot SF-Vorrichtung (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) platziert punktiert. Die Membran wurde mit 5 & mgr; l / Vertiefung von fetalem Rinderserum mit 1% Tris-gepufferte Kochsalzlösung blockiert. Dann wurden 5 & mgr; l eines handelsüblichen Konjugat (peroxidaselabeled HIV-Proteine; Murex Diagnostics, Norcross, USA) wurde zugegeben, und man ließ durch die Schwerkraft entleeren. Schließlich wurden 5 ul des Substrats 3,3’ , 5,5'-Tetramethylbenzidin (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) wurde zugegeben und die Mischung wurde 20 min lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Waschen des Wells mit destilliertem Wasser unter Vakuum gestoppt. Die Membran wurde nach links für die endgültige Farbvisualisierung Lese trocknet zuvor beschriebene Verfahren unter Verwendung von [8].

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Fakultät der Medizinischen Wissenschaften, die Universität von Westindien, Mona, Jamaika genehmigt.

Die Ergebnisse der Studie ist in Tabelle 1 dargestellt, dass der ELISA gibt eine positive Reaktion zeigt, für anti-HIV-Antikörper in Proben von Hühnern, Katzen und Ratten, wie sie alle entwickelten Farbreaktionen. Und, wie unten in der Figur dargestellt, zeigten die Ergebnisse, dass die Dot-Blot-Analysen wurden effizient und nützlich bei der Erkennung der Proteine, wie sie während des Prozesses oder die Reaktionen (1) getrennt wurden.

Abbildung 1: Dot-Blot-Analyseergebnisse für den Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern im Serum von mehreren Tieren und menschlichen getestet.

Tabelle 1: Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von anti-HIVgp120
Antikörper in Proben von Hühnern, Katzen und Ratten.

Diskussion

Der ELISA wurde erfolgreich bei der Detektion von anti-HIV-Antikörpern und die Dot-Blot-Analyse bestätigte die Ergebnisse und damit bewiesen, effizient bei der Trennung von Anti-HIV-Antikörper gegen das Fragment 254-274 von gp120 des menschlichen Immunschwächevirus. Der Dot-Blot kann zur Trennung eines spezifischen Proteins in Serum, Speichel, Hybridomkulturüberständen und anderen Flüssigkeiten verwendet werden. Es ist nicht zu den verwendbaren Trenntechniken gesehen, aber es ist sehr empfindlich und spezifisch, und kann für viele immunologischen Forschungsprojekte eingesetzt werden, wo solche, die Trennung eines Analyten erforderlich ist, sowie Western-Blot, Northern Blot und Southern Blotting.

Dot-Blot-Analyse wurde in der Selektion und Charakterisierung von DNA-Aptameren (oder DNA-Stück für eine Hybridisierung) zur Verwendung bei der Detektion des Geflügelpest-Virus H5N19 [9] und als diagnostische Technik wurde in einem Screening-Test zum Nachweis von anti-HIV verwendet -1 IgA bei jungen Säuglingen [9]. Häufig wird diese Technik nicht ausgelastet oder nicht häufig verwendet, weil es nicht das Molekulargewicht von Makromolekülen beurteilen kann. aber es ist einfach durchzuführen und ist nützlich, wenn ein bestimmtes Biomolekül identifiziert werden muss. In dieser Studie wurde die Dot-Blot-Analyse zum Nachweis von anti-HIV-Antikörper verwendet, und es ist für die Bestimmung oder die Trennung von jedem Protein vorhanden. Es kann in der Immundiagnose von Infektionskrankheiten, die durch Viren, [10] und Bakterien [1, 11, 12], zusätzlich zur Bestimmung spezifische DNA-Sequenzen unter Verwendung von Sonden, [10], verursachte sehr nützlich sein.

Schlussfolgerung

Dot-Blot-Analyse erweist sich wirksam bei der Trennung von HIV-gp120-Antikörper anti in mehreren Tierarten, darunter Hühner, Katzen und Ratten. Diese Antikörper können als Reagenzien bei der Entwicklung von immundiagnostischer Tests oder als orale Impfstoffe verwendet werden.

Referenzen

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