RP-HPLC-Methode Entwicklung und Validierung für die gleichzeitige quantitative Bestimmung von Metronidazol
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Int J Pharm Pharm Sci, Band 7, Heft 2, 367-371 Originalarbeit
Ziel: Um eine genaue, präzise und lineare Phase zu entwickeln Hochleistungsflüssigchromatographisches (RP-HPLC) Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von Metronidazol und Nalidixinsäure in Tabletten umkehren und validieren gemäß ICH-Richtlinien.
Methoden: Die optimierte Verfahren verwendet eine Umkehrphasen-C18-Säule Inertsil ODS C18-Säule (250X4.6 mm × 5μ) mobile Phase, bestehend aus gemischten Phosphatpuffer (pH 4,5; KH 2 PO 4 + K2 HPO4): Methanol: Acetonitril im Verhältnis von 30: 50:20 v / v. Die mobile Phase mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml / min und das Volumen wurde für jede Injektion 20 ul injiziert eingestellt. Die Nachweiswellenlänge wurde bei 271 nm eingestellt.
Ergebnisse: Die entwickelte Methode in Metronidazol führte bei 2,92 min und Nalidixinsäure bei 3,99 min eluiert wurde. Metronidazol zeigte Linearität im Bereich 30-70μg / ml, während Nalidixinsäure Linearität im Bereich 45-105μg / ml aufwiesen. Die Genauigkeit wird durch die relative Standardabweichung von 0,714% für Metronidazol und 0,398% für Nalidixinsäure exemplifiziert. Prozentual wurden mittlere Wiederfindung gefunden im Bereich von 98 bis 102, während Genauigkeit Studien zu sein. Die Nachweisgrenze (LOD) für Metronidazol und Nalidixinsäure wurden als 2.48μg gefunden / ml und 2.24μg / ml, während die Grenze des quantitiation (LOQ) für Metronidazol und Nalidixinsäure wurden als 7.51μg / ml und 6.79μg gefunden / ml.
Stichwort: RP-HPLC, Metronidazol, Nalidixinsäure, Verfahrensentwicklung, Validierung.
Metronidazol (Fig. 1) ist chemisch 2- (2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl) ethanol [1]. Metronidazol ist ein Imidazol nitro Antibiotikums verwendet gegen anaerobe Organismen, Infektionen und Amoebozoa antiprotozoal. Es wird häufig für leichte bis mittelschwere Clostridium difficile-Infektion verwendet [2]. Metronidazol wird auch zur Behandlung von bakteriellen Vaginose, entzündliche Erkrankungen des Beckens, Pseudomembrankolik verwendet. Aspirations-Pneumonie. Rosacea. vegetirenden Wunden, intra-abdominale Infektionen, Lungenabszess, Gingivitis, Amöbiasis, Giardiasis, Trichomoniasis, und die durch empfindliche anaerobe Organismen, wie Bacteroides fragilis spp verursachten Infektionen. Fusobacterium spp. Clostridium spp, Peptostreptococcus spp und Prevotellaspp [3]. Es hat ein Molekularformel C6 H9 N3 O3 und ein Molekulargewicht von 171,15 g / mol.
Fig. 1: Struktur von Metronidazol
Nalidixinsäure (Abb. 2) ist chemisch 1-Ethyl-1,4-dihydro-7-methyl-4-oxo-1,8-naphthyridin-3-carbonsäure. Es ist ein synthetisches Chinolon-Antibiotikum wirksam gegen sowohl Gram-positive und Gram-negativen Bakterien. Bei niedrigeren Konzentrationen, wirkt es als bakteriostatisches und bei höheren Konzentrationen; es ist bakterizid [4]. Nalidixinsäure ist ein Inhibitor der A-Untereinheit von bakterieller DNA-Gyrase. Nalidixinsäure und wird zur Behandlung von Harnwegsinfektionen durch empfindliche Gram-negative Mikroorganismen, einschließlich der Mehrheit der E. Coli, Enterobacter-Spezies, Klebsiella-Spezies und Proteus-Spezies verursacht werden, angezeigt. Es funktioniert durch die Bakterien zu töten und ihren Wachstum-Darm-Trakt zu verhindern, indem die Produktion von Proteinen, zu stoppen durch die Bakterien benötigt, um zu überleben. Es hat eine Molekülformel von C 12 H 12 N 2 O 3 und ein Molekulargewicht von 232,235 g / mol.
Abb. 2: Aufbau von Nalidixinsäure
Eine ausführliche Literaturübersicht zeigt, dass es Literatur über chromatographische Methoden für Nalidixinsäure und Metronidazol einzeln als auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln [4-24] in verschiedenen Matrices vorhanden ist. Es existiert spektrophotometrische [25], HPTLC [26] und überkritisches Fluid chromatographisches Verfahren [27] für die gleichzeitige quantitative Bestimmung von Metronidazol und Nalidixinsäure in pharmazeutischen Dosierungsformen, während es kaum Literatur berichtete über RP-HPLC-Methode Entwicklung und Validierung für diese Kombination. Daher haben wir bei der Entwicklung eines neuen, genau, präzise, lineare und eine schnelle isokratischen RP-HPLC-Verfahren für die gleichzeitige quantitative Bestimmung von Metronidazol und Nalidixinsäure in Tabletten und validieren gemäß ICH-Richtlinien geprüft.
MATERIALEN UND METHODEN
Chemikalien und Reagenzien
Analytisch reine Probe von Metronidazol und Nalidixic mit Reinheiten Säure größer als 99% wurde als Geschenk Proben von Chandra Labs, Hyderabad und Tablettenformulierung [Gramogyl DISTAB] wurde aus MedPlus pharmacy beschafft erhalten, Hyderabad mit markiertem Menge 100 mg und 150 mg Metronidazol und Nalidixinsäure sind. Acetonitril (HPLC-Qualität) und Methanol (HPLC-Qualität) wurden von Sigma Aldrich (Hyderabad, Indien) und SD Fein chem erhalten. (Hyderabad) bzw. Wasser (HPLC-Qualität), Kaliumdihydrogenphosphat ortho-Phosphat (KH 2 PO 4) und Di Kaliumhydrogenorthophosphat (K2 HPO4) (AR-Qualität), ortho Phosphorsäure (AR-Qualität) wurde von SD Feinchemikalien erhalten (Hyderabad, Indien), 0,45 um Nylonmembranfilter wurden von Spincotech private Limited, Hyderabad, Indien, erhalten.
HPLC-Analyse wurde auf Shimadzu LC-20AT VP Flüssigchromatograph, umfassend ein LC-20AT-Pumpe, Shimadzu SPD-20A UV-VIS-Detektor und einer Umkehrphasen-C18-Säule durchgeführt, Inertsil ODS 3V (250X4.6 mm; 5μ). Ein manuell Rheodyne Injektor mit 20 & mgr; l-Probenschleife betrieben wurde, wurde mit dem HPLC-System ausgestattet. Das HPLC-System wurde mit „Spinchrom“ Software gesteuert. Eine Doppelstrahl-UV-Spektralphotometer Nicolet sichtbare evolution 100 zwei angepaßte Quarzküvetten mit 1 cm Lichtweg aufweisen, wurde für die Aufzeichnung von Spektren und Messung der Absorption verwendet. Eine elektronische analytische Waage (1 mg Empfindlichkeit, Shimadzu BL220H), Digital-pH-Meter (Global digital) und Beschallungsgerät (Citizen) wurde in dieser Studie verwendet.
Auswahl der Wellenlänge
Geeignete Wellenlänge für die HPLC-Analyse wurde durch Aufzeichnen UV-Spektren im Bereich von 200-400 nm für die individuellen Arzneimittellösungen Nalidixinsäure und Metronidazol bestimmt. Geeignete Wellenlänge für die gleichzeitige Schätzung ausgewählt ist 271 nm (Abb. 3-4).
Abb. 3: UV-Spektrum von Standard Metronidazol
Abb. 4: UV-Spektrum von Standard Nalidixinsäure
Das optimierte Verfahren verwendet eine Umkehrphasen-C18-Säule Inertsil ODS C18-Säule (250X4.6 mm × 5μ) mobile Phase, bestehend aus gemischten Phosphatpuffer (pH 4,5; KH 2 PO 4 + K2 HPO4): Methanol: Acetonitril im Verhältnis von 30:50: 20 v / v. Die mobile Phase mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml / min und das Volumen wurde für jede Injektion 20 ul injiziert eingestellt. Die Nachweiswellenlänge wurde bei 271 nm eingestellt.
Herstellung von Mischpufferlösung
1,625 g Kaliumdihydrogenphosphat orth Phosphat (KH 2 PO 4) und 0,3 g Di-Kaliumhydrogenphosphat-ortho (K2 HPO4) wurde in 100 ml Wasser und das Volumen wurde hergestellt auf 1000 ml mit Wasser gewogen und gelöst. Den pH-Wert auf 4,5 unter Verwendung von ortho Phosphorsäure und Kalilauge. Der Puffer wurde durch 0.45μ Filter filtriert, um alle feinen Partikel und Gase zu entfernen.
Vorbereitung der mobilen Phase
Die mobile Phase wurde durch Vermischen von Acetonitril, Methanol und gemischte Phosphatpuffer im Verhältnis von 20.50.30 v / v hergestellt und später wurde es für 10 Minuten zur Entfernung von Luftblasen mit Ultraschall behandelt.
Verdünnungsmittel verwendet wird, ist die mobile Phase selbst.
Herstellung von gemischter Standardlösung
Wiegen akkurat 75mg Nalidixinsäure und 50 mg Metronidazol in 100 ml-Meßkolben und löst in 10 ml der mobilen Phase, und das Volumen mit mobiler Phase bilden. Von oben Stammlösung 75μg / ml Nalidixinsäure und 50 ug / ml von Metronidazol wird durch Verdünnen von 1 ml bis 10 ml mit mobiler Phase hergestellt. Dies wird als gemischte Arbeitsstandards Lösung behandelt, 100% Zielkonzentration.
Herstellung von Stamm- und Arbeitsprobenlösung
10 Tabletten wurden abgewogen und in einem Mörser entnommen, zerkleinert und dann gleichmßig vermischt. Test Stammlösungen von Nalidixinsäure (1500μg / ml) und Metronidazol (1000 ug / ml) wurden durch Auflösen von durchschnittlich 10 Tabletten, äquivalent zu 150mg Nalidixinsäure und 100 mg Metronidazol und aufgefüllt auf 100 ml mit der mobilen Phase hergestellt. Beschallt 5 min später und filtriert die Lösung 0.45micron Spritzenfilter. 0,5 ml der obigen Stammlösung wurde abpipettiert und auf 10 ml bis Arbeitsprobenlösung äquivalent zu einer Konzentration von 75μg / ml Nalidixinsäure und 50 ug / ml für Metronidazol, Konzentrationen gleich 100% Zielkonzentration zu erhalten.
RESULTATE UND DISKUSSION
Eine Umkehrphasen-HPLC-Methode wurde im Sinn i entwickelt halten die Systemeignungsparameter. e. Auflösungsfaktor (Rs) zwischen den Spitzen, Asymmetric Faktor (A), der Anzahl der theoretischen Böden (N), der Laufzeit und der Wirtschaftlichkeit. Das optimierte Verfahren entwickelt, führte zu der Elution von Nalidixinsäure bei 3,99 min und Metronidazol bei 2,92 min. Fig. 5 und 6 stellen Chromatogramme der Blindlösung und eine Mischung von Standardlösungen sind. Die Gesamtlaufzeit beträgt 6 Minuten.
Systemeignungstests sind ein integraler Bestandteil der Entwicklung und Verfahren verwendet werden, um eine angemessene Leistung des chromatographischen Systems zu gewährleisten. Retentionszeit (Rt), die Anzahl der theoretischen Böden (N), Peak-Auflösung (Rs) und Asymmetrische Faktor (A) wurde bei Arbeitskonzentration für sechs wiederholte Injektionen der Standards bewertet. Die Ergebnisse in Tabelle 1 angegeben waren innerhalb akzeptabler Grenzen.
Abb. 5: Typisches Chromatogramm von Blindlösung
Abb. 6: Typische Chromatogramm Mischung aus Standards Lösung
Abb. 7: typisches Chromatogramm der Probenlösung
Tabelle 1: Systemeignungs Studien Ergebnisse
Um die Anwendbarkeit des entwickelten Verfahrens auf eine handelsübliche Formulierung zu testen, Tabletten ‚Gramogyl DISTAB‘ wurden bei Arbeitskonzentration und es wird gezeigt in Fig chromatographiert. 7. Die Probenpeaks wurden identifiziert, indem die relativen Retentionszeiten mit der Mischung aus Lösung Standards verglichen (Abb. 6-7). Systemeignungsparameter waren innerhalb der Akzeptanzgrenzen, ideal für die chromatographierte Probe. Integration der Peakfläche getrennt wurde durchgeführt, und jede Arzneimittelkonzentration wurde unter Verwendung der Peakfläche Konzentration Beziehung in dem Standardisierungsschritt erhalten wird, bestimmt. Das Protokoll liefert reproduzierbare Quantifizierung der beiden Medikamente mit Fehlern von weniger als 10%, was die Standard-Ebene in jeder pharmazeutischen Qualitätskontrolle ist.
Abb. 5-7 für leer, Mischung von Standards Arzneimittellösung und Probenchromatogramm zeigen, dass die Spitzen in der Standard-Lösung und Probenlösung bei Arbeitskonzentrationen erhalten werden, sind nur wegen der Drogen als Rohling hat keinen Peak bei der Retentionszeit von Nalidixinsäure und Metronidazol-Standards. Dementsprechend kann gefolgert werden, dass, entwickelte das Verfahren soll spezifisch sein.
Sechs wiederholte Injektionen der Mischung von Standards Lösung bei Arbeitskonzentration zeigten% RSD (relative Standardabweichung) von weniger als 2 über Peakfläche für die beiden Medikamente, die die akzeptable Reproduzierbarkeit zeigen und dadurch die Genauigkeit des Systems. Systemgenauigkeit Ergebnisse sind in den Tabellen 2-3 aufgeführt.
Verfahren Präzision wurde durch die Durchführung des Tests der Probe unter dem Test der Wiederholbarkeit (Intraday Genauigkeit) bei Arbeitskonzentrationen bestimmt.
Wiederholbarkeit (Intraday precision)
Sechs aufeinanderfolgende Injektionen der Probe aus der gleichen homogenen Mischung bei Arbeitskonzentration zeigten% RSD von weniger als 2 in Bezug auf% Assay sowohl für die Medikamente, die zeigen, dass das Verfahren entwickelte Verfahren präzise durch den Test der Wiederholbarkeit und daher kann verstanden werden, dass das Verfahren ergibt konsistent reproduzierbare Ergebnisse (Tabelle 4).
Tabelle 2: Ergebnisse Systemgenauigkeit Nalidixinsäure
Abb. 9: Diagramm des Linearitäts Metronidazole
Die Genauigkeit wurde durch Wiederfindungsversuche bestimmt, durch die Bestimmung von% mittlere Wiederfindung der beiden Medikamente auf drei verschiedenen Ebenen (80-120%). Auf jeder Ebene wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Prozent mittlere Wiederfindungsrate ist in Tabelle 7. Die akzeptierten Grenzen der mittleren Wiederfindung sind 98% -102% wie gezeigt berechnet und alle beobachteten Daten im geforderten Bereich waren, die Werte gute Erholung zeigt und damit die Genauigkeit der entwickelten Methode.
Tabelle 7: Ergebnisse der Genauigkeit Studien für Metronidazol und Nalidixinsäure
% Mittlere Erholung Metronidazol
% Mittlere Erholung Nalidixinsäure
Die Empfindlichkeit der Messung von Metronidazol und Nalidixinsäure durch Verwendung des vorgeschlagenen Verfahrens wurde im Hinblick auf die Nachweisgrenze (LOQ) und Nachweisgrenze (LOD) geschätzt. LOQ und LOD wurden durch die Verwendung der Gleichungen berechnet LOD = 3.3σ / S und LOQ = 10σ / S, wo σ die Standardabweichung der Antwort des Eichkurven ist und S die Steigung der entsprechenden Eichkurve. Die Nachweisgrenze (LOD) für Metronidazol und Nalidixinsäure wurden als 2.48μg gefunden / ml und 2.24μg / ml, während die Grenze des quantitiation (LOQ) für Metronidazol und Nalidixinsäure wurden als 7.51μg / ml und 6.79μg gefunden / ml.
Die Autoren möchten die Verwaltung von Chandra Labs, Hyderabad, danken wir für die notwendigen Einrichtungen bietet aus dieser Forschungsarbeit zu tragen und auch für Medikamente in Form von Geschenk Proben bereitstellt.
INTERESSENKONFLIKT