Technische Hilfe FAQ für Silver Enhancement
- Führer zu Gold-Nanopartikeln Labeling
Detaillierte Beschreibung der Gold-Nanopartikel-Kennzeichnung, Tipps und Tricks für eine erfolgreiche Konjugationen, Isolierung von Konjugate und wie eine Markierung zu berechnen.
Das Silber-Enhancer soll ich verwenden - HQ Silber oder LI Silber?
Es hängt davon ab, welche Überlegungen wichtiger für Sie sind. HQ Silber sollen der gleichmäßige Partikelgröße ergeben: es hat ein schützendes Verdickungsmittel (ähnlich den Danscher Prozess), die die Silberverstärkung moderieren Prozess gefunden wurde. Ihr pH-Wert ist näher an neutralen und seine Ionenstärke ist gering, was einige Forscher glauben, ultra Erhaltung verbessert. LI Silber ist bequemer zu verwenden (es ist ein Zweikomponenten-Reagenz, während HQ Silber ist ein 3-Flaschen-Kit), und die Reaktion ist langsamer, mehr Kontrolle ermöglicht. Es ist auch lichtstabil.
Wie kann ich das Hintergrundsignal zu reduzieren?
- Stellen Sie sicher, dass alle Proben gründlich mit ultrareinem oder deionisiertem Wasser vor der Silberverstärkung gewaschen, sind: Halogenid- oder andere Silber ausfälle Anionen bewirkt ein Niederschlag zu bilden, der sich in der EM sichtbar ist und zusätzliche Hintergrundfärbung nukleieren.
- Wash Proben mit einem Chelatbildner vor Silberverstärkung. Wir verwenden in der Regel-EDTA (0,05 M, pH 4,6) auf Blots als letzte Wäsche vor der Silberverstärkung Reagenzzugabeposition.
- Saubere Glaswaren (zum Mischen der Reagenzien, die Handhabung oder Lagerung Proben Silber Enhancer) mit Farmer-Lösung für mindestens 20-30 Minuten. Farmer-Lösung besteht aus 9 Teilen 10% igem Natriumthiosulfat mit 1 Teil 10% Kaliumferricyanid.
- Verwenden Kunststoff oder teflonisiert (nicht Metall) Zangen und Werkzeuge für die Proben handhaben.
Es gibt zwei Ansätze zur Verringerung der Hintergrundfärbung: (a) ändern, um die experimentellen Bedingungen vor und während der Silberverstärkung; oder (b) die Verbesserung der „Anhalten“ der Silberverstärkung Reaktion oder anwenden zurück Entwicklung, nachdem es abgeschlossen ist.
Reduzierung des Hintergrunds während der Reaktion
In Experimenten mit dem kombinierten Fluorescein und Nanogold ® Sonde FluoroNanogold wurde festgestellt, dass das Waschen mit 0,02 M Natriumcitratpuffer, pH 7,0, vor Silberverstärkung deutlich niedrige Hintergründe als viele andere Behandlungen gibt. Dies wurde festgestellt, um wirksam zu sein, wenn der Danscher Silber-Enhancer für die Entwicklung verwendet wurde. Als Nanosonden HQ Silber verwendet wurden, 0,02 M Natriumcitratpuffer bei pH 3,5 unmittelbar vor gab Silberverstärkung niedrigen Hintergrund. In Immunblots finden wir, dass 0,05 M EDTA, pH 4,6, vor Silberverstärkung hilft auch Hintergrund zu minimieren.
Die Zugabe einer geringen Menge des Detergens Tween-20 zu dem Nanogold ® Inkubationspuffer hilft hydrophobe Wechselwirkungen zu verhindern, was eine weitere Quelle der nicht-spezifischen Bindung sein kann. Wenn die Probe kann es tolerieren, mit 0,6 M Triethylammoniumbicarbonat-Puffer gewaschen, in denen Nanogold ® stark löslich ist, kann auch niedrigen Hintergrund. Herstellung von Triethylammonium-Hydrogencarbonat-Puffer ist in der folgenden Referenz beschrieben:
- Safer, D .; Bolinger, L. und Leigh, J. S .; J. Inorg. Biochem. 26 77 (1986).
„Stop“ Reaktionen und Rückentwicklung:
- 1% Essigsäure.
- 1% Essigsäure, gefolgt von photographischer Fixierlösung (Agefix, Agfa-Gevaert, oder Ilfospeed 200, Ilford).
- direkte Foto fix, mit denjenigen, die gerade.
- kurze Spülen in 2,5% Natriumchlorid.
- 15-25% igen wässrigen Natriumthiosulfat plus 15% Natriumsulfit.
- 1% Essigsäure, Waschen in Acetatpuffer, in 0,05% HAuCl4 3-10 min Tonen, mit überschüssigem Silber mit 3% igem Natriumthiosulfat entfernt. Wir fanden, dass Nanogold-markierte Proteine auf einem Polyacrylamid-Gel laufen gelassen niedrigen Hintergrund gehalten, wenn sie mit 10% iger Essigsäure mit 10% Glucose in Wasser gestoppt, im Gegensatz zu nur einer Wassersperre.
Diese Methoden und ihre Referenzen werden in unserer kürzlich durchgeführten Überprüfung Nanogold ® Technologie diskutiert: