Unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Blockierungsmittel

Western Blot mit BSA als Blockierungsmittel

10x Phosphate Buffered Saline.PBS (für Methanol aus Blots entfernen)
NaCl 80 g (1,37 M für 10x)
KCl 2 g (27 mM für 10x)
Na 2 HPO 4 (80 mm für 10-fach)
KH2 PO4 (20 mM für 10x)
Wasser auf 1 l
pH-Wert auf 7,4 mit HCl

PBS Tween.PBST (zum Waschen blots)
PBS 2L
Tween-20 (Brown Flasche) + 1 ml durch Pipettieren mit Pipettor oder Kunststoffbirne
rührt eine halbe Stunde

Blotting
1. Befeuchten eines getrockneten, überführt blot mit Methanol, wenn der Blot mit PVDF hergestellt wird, oder in PBS tränken, wenn blot aus Nitrocellulose hergestellt ist (man beachte, daß Methanol toxisch ist, so Handschuhe tragen und don.t es inhalieren) FOR Nitrocelluloseblots DON. T WET mit Methanol, oder IT.LL DISTINTEGRATE IN DER HAND
2. spülen

5x PBST 5-10 Minuten je
(Beachten Sie, dass Meerrettich-Peroxidase-Enzym und damit temperaturempfindlich, so ist es am besten, es bei 4 Grad zu lassen, wenn Sie nicht sofort können auch weiterhin zu entwickeln, aber nicht versuchen, es zu lange bei 4 Grad zu verlassen [1-2 Stunden ist wahrscheinlich OK])

Anzeigen des Blot
1. Mischen gleicher Mengen von Lösung A - B von ECL (

1,5 ml jedes von A - B)
2. Gesteins manuell für 1 min.
3. Wrap Saran Wrap-around-Blots
4. ausziehen Handschuhe beim Filmtransport
5. schalten Sie alle Lichter (kann ein schwaches rotes Licht auf lassen), wenn der Film aus dem Kasten zu entfernen und Platz verbleibenden Film zurück in den Kasten, bevor sie mit dem neu ausgebauten Stück Film zu tun
6. Ort Film auf der Oberseite der Blot in der Filmkassette, eine Kenntnis von der Orientierung der Folie zu machen
7. belichten für 15sec -2 Minuten und, falls erforderlich, einen weiteren Film verwenden, und für die Anthere 20 min belichten.
8. Entwicklung des Blots

Immunofluoreszenz mit BSA als Blockierungsmittel

5x PB-Puffer (= 250 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, nach der Verdünnung)
Um sicherzustellen, 500 ml,
Mischen Sie 140 ml 0,25 M NaH 2 P04
+ 360 ml 0,25 M NaH 2 P04
ODER
1x PB, 500 ml
35 ml 0,2 M NaH 2 P04
90 ml 0,2 M NaH 2 P04
375 ml Wasser
1x PB wird im Folgenden für die Verfahren erforderlich

20% Triton
. Wiegen Sie 2 g Triton auf einer Waage durch Pipettieren in ein Rohr,
. Machen Sie bis zu 10 ml mit destilliertem Wasser
. Rock über Nacht

4% Paraformaldehyd (einrühren Abzug,)
Zu 50 ml zu machen,
. benutzen

40 ml Wasser 2 g Paraformaldehyd lösen
. 200UL 0,2 N NAOH und Wärme hinzufügen, während im Abzugsschrank Rühren
. Einmal gelöst, 10 ml + 5x Puffer PB
. gefrieren in

10-15 ml Aliquots in dem .20 Gefrierschrank

Normale Ziege Serum.NGS
. Speicher in Teilmengen in der Gefrierschrank

Notizen:
. wenn nach Fixierung der Zellen, lassen Sie sie in den Kühlschrank nass, mit dem PB aus dem Wasch bedeckt
. Vorsicht beim Pipettieren und Entfernen von Lösungen; andernfalls wird kommen Zellen aus

ELISA mit BSA als Blockierungsmittel

Nunc-Mikrotiterplatten (Bindungsmedium) F96 Polysorp 475.094 (RIA-Platten)
Maxisorp F96 442404

ABTS (erhältlich bei Sigma, zum Beispiel)

Puffer A
Dinatriumhydrogenorthophosphat 1 M (20 ml Wasser)
1 M Zitronensäure (16 ml Wasser)
Kombinieren und mit Wasser auf 164 ml, pH-Wert auf 4,0
Shop im Dunkeln bei Raumtemperatur

Haben Proben in dreifacher Ausfertigung

+60uL jede Lösung in die Vertiefung jedes Mal; Wäschen / Spülungen werden angewendet, um die gut und entfernt zu füllen, durch Umdrehen der Platte und schleudert überschüssige Lösung aus

Man beachte, dass alle Proteine ​​(einschließlich BSA) verwenden 1x PBS als Verdünnungsmittel

Variationen umfassen zur Anwendung bestimmter Proteine ​​eine serielle oder 10-fach unter Verwendung von Verdünnungs

Kann verwendet Multikanalpipette Lieferung von Lösungen für Mikrotiterplatten zu beschleunigen

- Platte Protein 1 über Nacht bei 37 Grad im Inkubator (ihn mit einem 1 ml Pipettierspitze Kasten) - verdünnte Protein zu 1 bis 100 ug / ml
- Spülen mit PBS
- Block mit 4% BSA in PBS, 1 Stunde
- Spülen mit PBS
- In BSA Protein 2 + 0,1%
- Inkubieren 1-4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 37 Grad Celsius
- Waschen 3x mit PBS-Tween
- Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Protein 3 + 0,1% (falls vorhanden) BSA
- Waschen 3x mit PBS-Tween
- Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 4 oder Protein-Antikörper, der an konjugiert ist - Peroxidase (das Peroxidase-konjugiertem Protein oder Antikörper 1/1000 mit PBS-Tween verdünnt) + 0,1% BSA
- 5-6x waschen mit PBS-Tween
- Entwicklungslösung (5 mg ABTS in 10 ml Puffer A + 10 ul H2 O2). machen kurz vor dem Gebrauch und halten im Dunkeln vor der Verwendung
- Warten Sie 15 Minuten (Put-Folie um es Licht zu verhindern, erreicht es)
- Lesen Sie die Mikrotiterplatte mit einem Plattenlesegerät bei 405 nm