Wie Sie das Beste cDNA für Genisolation Get - Bitesize Bio
cDNA (komplementäre DNA) ist ein äußerst nützliches Werkzeug - begabt Molekularbiologen von RNA-Viren, die glücklicherweise das Enzym Reverse Transkriptase „erfunden“, die uns die Sachen machen kann.
RNA-Viren nutzen diese mRNA abhängige DNA-Polymerase ihre einzelsträngige Genom in doppelsträngige für die Integration in ihre Wirtsgenom DNA zu konvertieren. Aber im Labor, kann sie genutzt werden, um cDNA-Kopien von mRNA-Vorlagen. Das bedeutet, dass der reversen Transkriptase kann eine cDNA-Kopie jeden mRNA synthetisiert verwendet werden, die in einem mRNA-Extrakt vorhanden ist, und das ist eine ziemlich nützliche Sache tun zu können.
Vorteile der cDNA über Genomic DNA
Da von diesen cDNA-Kopien können Sie Dinge wie PCR tun ein Gen von Interesse, verstärken oder eine cDNA-Bibliothek machen, und die Sonde für eine bestimmte Sequenz oder Aktivität. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung cDNA wie dies zu tun, um genomische DNA Gegensatz:
- Keine Introns: Eukaryote Gene enthalten üblicherweise Introns (nicht-kodierende Sequenzen). Diese werden nach der mRNA-Synthese entfernt, so cDNA keine Introns enthält. Dies bedeutet, dass eine cDNA-Kopie eines Gens als ein einziges, intronfreie Fragment isoliert werden. Prokaryoten haben keine Introns so dass dies kein Problem ist, wenn Sie mit bakteriellen Genen arbeiten.
- Weitere Vorlage: Es gibt mehrere Kopien von mRNA für jede Kopie im Genom, so bedeutet, dass Sie mehr Kopien pro Zelle der Sequenz von Interesse erhalten.
- Weniger Hintergrund Sequenz: Da nur Sequenzen, die als mRNA exprimiert wurden, werden in einem cDNA-prep vorhanden sein, gibt es weniger Hintergrund-Sequenz im Vergleich zu genomischer DNA, die es weniger wahrscheinlich macht, dass Ihre Primer unspezifisch binden.
Das ist die Grundlagen, aber für den Rest dieses Artikels werde ich auf ein Thema konzentrieren, die die von Ihnen vielleicht betreffen, die Gene mit gewebespezifischen Expressionsprofile isolieren müssen. Dafür benötigen Sie cDNA aus der gesamten mRNA Ergänzung Ihrer Gewebe der Wahl dann diese als Vorlage verwenden zu synthetisieren, um Ihr Zielgen zu verstärken.
Aber wie wählen Sie das richtige Gewebe Ihre cDNA aus zu isolieren? Ich werde Ihnen sagen, wie. Machen wir es falsch, und Sie könnten Ihre Strategie zu überdenken - ich werde Ihnen sagen, wie das zu tun.
Wie man eine gute Quelle zur Auswahl für die Herstellung Ihrer cDNA-Bibliothek
Die mRNA verwendet, um cDNA zu machen, ist aus verschiedenen Geweben des Körpers extrahiert (z. B. Gehirn, Niere, Leber) oder weniger häufig aus kultivierten Zellen (z. B. HeLa-Zellen). cDNA repräsentiert den Pool von Genen in einem Gewebe exprimiert, und gegeben, dass jedes Organ eine andere Funktion im Körper hat, jedes Gewebe unterschiedliche Expressionsniveaus von jedem Gen aufweist. mit so vielen Geweben so zu wählen, was ist das beste Gewebe cDNA zur Isolierung Ihres Gens zu benutzen?
Die kurze Antwort ist derjenige, der höchste Ausdruck des Gens hat. Das reichliche das Gen in dem Gewebe exprimiert wird, desto wahrscheinlicher werden Sie Ihre Gen durch PCR isolieren, weil es mehr Vorlage zu verstärken ab.
Haben Sie einen Go an der PCR
Wenn Sie nicht die erforderliche Band, versuchen Sie zuerst die PCR-Reaktion zu optimieren selbst. Zusätze wie Betain könnten helfen, und so könnte diese PCR-Checkliste zur Fehlerbehebung. Wenn dies aber nicht nachgibt Ergebnisse - was als nächstes?
Fügen Sie mehr cDNA-Matrize
Der häufigste Grund für erfolglose Isolierung eines Ziels von cDNA ist, dass die cDNA nicht für eine erfolgreiche Amplifikation genug des Ziels enthält. mehr Vorlage Hinzufügen der Konzentration des Ziels zu erhöhen oft funktioniert, aber in der Regel eine neue cDNA ist der Ansatz, die getroffen werden muss. Wenn dies nicht funktioniert, könnte es bedeuten, dass Ihr Ziel-Gen schlecht exprimiert wird, oder auch nicht, in dem Gewebe ausgewählt Sie so ...
Versuchen Sie, ein spezifisches Gewebe
Ein Trick für die Isolierung schwierig Ziele ist es, eine cDNA, die aus einer bestimmten Region des Gewebes verwenden Sie verwendet haben. Wenn man darüber nachdenkt, ein Organ (z. B. Gehirn) aus mehreren Funktionsteilen (z.B. Hippocampus, Hypophyse, Hypothalamus) und die Expression eines Gens in einer ganzen cDNA ist nur der Durchschnitt Ausdruck aller Teile dieses Organs.
Intuitiv dann gibt es immer gehen spezifischere Teil des Organs zu sein, die eine höhere Expression des Gens hat. Auffinden von Expressionsdaten auf spezifischere Bereiche eines Gewebes oder auch im Handel erhältliche Quellen von bestimmten Bereichen eines Organs zu finden, kann schwierig sein.
Versuchen Sie, ein verwandtes Gewebe
Ein weiterer Ansatz ist es, eine „verwandt“ Gewebe, um zu versuchen, wie ich es nennen möchte. Einmal hatte ich ein Gen, das bedeutet, wurde im Gehirn exprimiert werden, aber ich konnte nicht isoliere es aus dem Gehirn oder anderen spezifischere Bereichen. So habe ich ein „verwandt“ Gewebe, nämlich Retina cDNA, weil das Auge / Netzhaut, ähnlich wie das Gehirn, ist hauptsächlich Nervengewebe. Und siehe da, ich habe ein schönes Band von Retina-cDNA.
Die meisten Beispiele von „verwandten“ Gewebe fallen in die Kategorie der „Systeme“ Verwandtschafts. Im Folgenden finden Sie eine Liste von Geweben, der Teil verschiedenen Systeme, die zur Isolierung von Ziel verwendet werden könnten:
Wenn es zu viele Gewebe auf einmal versuchen, bündeln die cDNAs in einer Reaktion. Der Zweck cDNA von Pooling ist die Anzahl der Reaktionen zu reduzieren, die durchgeführt werden muss. Wenn Sie cDNA bündeln werden jedoch sicherstellen, dass Sie nicht jede cDNA verdünnen. Vielmehr fügen Sie so viel von jeder cDNA in der gepoolten Reaktion, wie man es in einer einzigen Reaktion. Dies stellt sicher, das Ziel in reichlich Gewebe wird nicht verdünnt, die den Erfolg der Reaktion beeinträchtigt.
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