Addgene Erstellen eines Glycerolstammlösung Ihrer Addgene Plasmid
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Hintergrundinformation
Bakterielle Glycerin Bestände sind wichtig für die langfristige Lagerung von Plasmiden. Obwohl Sie Ihre Plasmid-DNA bei -20 ° C lagern können, auch viele Labors Bakterienglycerinstamm ihrer Plasmide erstellen. Auf diese Weise, wenn Sie mehr Plasmid-DNA machen wollen, wird das Plasmid bereits in der gewünschten Bakterienstamm, und Sie werden nicht mehr kompetente Zellen und Rücktransformation erhalten müssen.
Bakterien auf einer LB-Agar-Platte können für ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Wenn Sie jedoch wollen für eine längere Zeit zu speichern, Bakterien, müssen Sie Glycerin Bestände aufzubauen. Die Zugabe von Glycerin stabilisiert die gefrorenen Bakterien, Schäden an den Zellmembranen zu verhindern und die Zellen am Leben zu erhalten. Ein Glycerolstammlösung von Bakterien kann stabil bei -80 ° C für viele Jahre gelagert werden.
Nach dem Bakterienwachstum haben, 500 & mgr; l der Übernachtkultur zu 500 ul 50% Glycerin in einem 2 ml Schraubdeckel Rohr oder Kryoröhrchen und vorsichtig mischen.
Hinweis: Stellen Sie die 50% Glycerin-Lösung durch Verdünnen von 100% Glycerin in dH 2 O.
Hinweis: Rasten obere Rohre sind nicht zu empfehlen, da sie unerwartet bei -80 ° C öffnen.
Einfrieren des Glycerin-Vorratsrohr bei -80 ° C. Die Aktie ist jetzt stabil seit Jahren, solange es bei -80 ° C gehalten wird. Holtes Einfrieren und Auftauen-Zyklen reduzieren Haltbarkeit.
Um Bakterien aus Glycerolstammlösung zu erholen, öffnen Sie das Rohr und eine sterile Schleife, Zahnstocher oder Pipettenspitze einige der gefrorenen Bakterien abkratzen von der Spitze. Sie nicht die Glycerolstammlösung auftauen lassen! Streak die Bakterien auf eine LB-Agarplatte, enthaltend das entsprechende Antibiotikum.Steigern Sie Ihre Bakterien über Nacht bei der geeigneten Temperatur (Wachstumsbedingungen, einschließlich der Kopienzahl und Wachstumstemperatur kann auf dem Plasmid Informationsseite zu finden) zu isolieren einzelne Bakterienkolonien bereit zur Beimpfung Plasmidpräparation Kulturen.
Tipps und FAQ
- Wie viel Glycerin soll ich verwenden?
Die optimale Konzentration der langfristigen Lagerung Glycerin ist nicht bekannt. Die meisten Labors Speicher Bakterien in 15-25% Glycerin. Addgene speichert alle unsere Bakterien in 25% Glycerin Aktien.
Nein! Sparen Sie Zeit und bereitet die Glycerolstammlösung zur gleichen Zeit, die Sie isolieren Ihren Plasmid-DNA. Am Morgen, wenn Sie Ihre flüssige Bakterienkultur abrufen, nehmen 500 ul der Kultur Ihre Glycerolstammlösung zu machen, bevor Sie Ihre Miniprep beginnen.
Versuchen Sie, nicht einfrieren / auftauen Ihre Glycerolstammlösung zu oft. Bei Addgene, wenn wir mehr von einem Plasmid wachsen wollen, legen wir Glycerolstammlösung auf Trockeneis während auf LB-Agar Ausstreichen, so dass es nie auftaut. Wir resequence unser Lager nach jeweils 100 Einsätzen.