Addgene Protokoll - Wie eine bakterielle Glycerolstammlösung erstellen
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- Erstellen Bakterielle Glycerol Stocks für Langzeitlagerung von Plasmiden
Hintergrundinformation
Bakterielle Glycerin Bestände sind wichtig für die langfristige Lagerung von Plasmiden. Obwohl Sie Ihre Plasmid-DNA bei -20 ° C lagern können, auch viele Labors Bakterienglycerinstamm ihrer Plasmide erstellen. Auf diese Weise, wenn Sie mehr Plasmid-DNA machen wollen, wird das Plasmid bereits in der gewünschten Bakterienstamm, und Sie werden nicht mehr kompetente Zellen und Rücktransformation erhalten müssen.
Bakterien auf einer LB-Agar-Platte können für ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Wenn Sie jedoch wollen für eine längere Zeit zu speichern, Bakterien, müssen Sie Glycerin Bestände aufzubauen. Die Zugabe von Glycerin stabilisiert die gefrorenen Bakterien, Schäden an den Zellmembranen zu verhindern und die Zellen am Leben zu erhalten. Ein Glycerolstammlösung von Bakterien kann stabil bei -80 ° C für viele Jahre gelagert werden.
Nach dem Bakterienwachstum haben, 500 & mgr; l der Übernachtkultur zu 500 ul 50% Glycerol in einem 2 ml Schraubdeckel Rohr oder Kryoröhrchen und vorsichtig mischen.
Hinweis: Stellen Sie die 50% Glycerin-Lösung von 100% Glycerin in dH20 zu verwässern.
Hinweis: Rasten obere Rohre sind nicht zu empfehlen, da sie unerwartet bei -80 ° C öffnen.
Einfrieren des Glycerin-Vorratsrohr bei -80 ° C. Die Aktie ist jetzt stabil seit Jahren, solange es bei -80 ° C gehalten wird. Holtes Einfrieren und Auftauen-Zyklen reduzieren Haltbarkeit.
Um Bakterien aus Glycerolstammlösung zu erholen, öffnen Sie das Rohr und eine sterile Schleife, Zahnstocher oder Pipettenspitze einige der gefrorenen Bakterien abkratzen von der Spitze. Nicht das Glycerolstammlösung unthaw lassen! Streak die Bakterien auf eine LB-Agarplatte.Steigern Sie Ihre Bakterien über Nacht bei der entsprechenden Temperatur. Die Wachstumsbedingungen, einschließlich der Kopienzahl und Wachstumstemperatur kann auf dem Plasmid Informationsseite. Am nächsten Tag können Sie am nächsten Tag eine Nacht Kultur für Plasmid-DNA-Präparation starten.
Tipps und FAQ
Die optimale Konzentration der langfristigen Lagerung Glycerin ist nicht bekannt. Die meisten Labors Speicher Bakterien in 15-25% Glycerin.
Sie können die Glycerolstammlösung zur gleichen Zeit bereiten Sie Ihre Plasmid-DNA herzustellen. Am Morgen, wenn Sie Ihre flüssige Bakterienkultur abrufen, nehmen 500 ul der Kultur Ihre Glycerolstammlösung zu machen, bevor Sie Ihren Plasmid-Mini-Prep beginnen.
Versuchen Sie, nicht einfrieren / auftauen Ihre Glycerolstammlösung zu oft. Platzieren den Glycerolstammlösung auf Trockeneis während auf LB-Agar Ausstreichen wird es verhindern, dass vollständig aufgetaut und die Haltbarkeit verbessern.
Es ist sehr wichtig, dass Sie das Glycerin vor dem Einfrieren (5-6 mal) schütteln. Stellen Sie sicher, dass Sie eine einheitliche Lösung zu sehen, und es gibt keine Schichten vorhanden.
Achten Sie darauf, sowohl den Deckel und den Schlauch eines Glycerolstammlösung beschriften, bevor Sie die Probe bei -80 ° C statt. Gefrorene Rohre sind hart und Proben für längere Zeit bei -80 ° C gelagert, schreiben können Etiketten Rohr stecken verlieren!