Aufbau einer besseren Bakterielle Glycerolstammlösung - Mikrobielle Pharm
Achten Sie darauf, die folgenden haben, die in irgendeiner Weise im Autoklaven behandelt oder sterilisiert wurden:
-LB-Platten mit geeigneten Antibiotikum
-Flüssige Bestände an geeigneten Antibiotikum
-sterile Schlaufen
-Master Glycerolstammlösung *
-Kompetente Zellen *
-Expressionsplasmids *
-Kultur-Flasche mit gefiltertem Stopper
-Sterile Terrific Broth, enthaltend 0,5% Glucose (w / v)
-30% W / V sterile Glycerin-Lösung - Chilled
-Sterile Resuspension Fahrzeug, abhängig von der Gesamtmenge an Glycerinstamm hergestellt ist (I Regel nicht mehr machen, als 20-40 zu einer Zeit, in der Regel so I ein sterile 50 ml konische Röhrchen verwenden)
-Sterile Cryo-Vials (in der Regel 1,2 ml)
-serologische Pipetten
(* Wenn eine Master-Glycerolstammlösung verwendet wird dann eine neue Transformation ist nicht erforderlich)
1) Eine frische Transformation, falls erforderlich, mit dem Expressionsplasmid. Für größere Proteine> 100 kDa Ich schlage vor, mit einer Erholung und Inkubation über Nacht Temperatur von 30 ° C statt 37 ° C, so scheint es, eine stabile Zelllinie zu schaffen. Die gesamte Transformation wird niedriger sein, so würde ich empfehlen, doppelt so viel Plattierung Koloniebildung zu gewährleisten.
2) sobald die Transformation abgeschlossen ist, streak Kultur auf LB-Platten plus dem entsprechenden Antibiotikum. Für E. coli ist das Kanamycin oder Ampicillin Allgemeinen. Wenn Ampicillin mit schlage ich vor Substitution Carbenicillin, da es weniger anfällig ist, um Beta-Lactamase-Abbau.
Streak einzelne Kolonien zu erhalten.
3) Inkubation über Nacht bei der gleichen Temperatur für Ihren Transformation Gewinnungsschritt verwendet.
4) Bereite einen 250 ml Kolben mit Strombrechern mit dem folgenden:
- 50 ml Sterile Terrific Broth, enthaltend 0,5% Glucose (w / v)
In entsprechende Menge an Antibiotika-Lager eine Endkonzentration von entweder 100 ug / ml zu erreichen -
(Für Ampicillin- / Carbenicillin) oder 50 ug / ml (Kanamycin)
5) beimpft Kolben mit 1-5 Kolonien von LB-Platte
6) Inkubiere Kolben bei derselben Temperatur für die Transformation verwendet.
7) Sobald Kultur bei einer OD von 1-5 ist, dass Sie bereit sind, eine Phiole. Für E. coli nimmt dies weniger als 3 Stunden und bis zu zehn Stunden, wie Stämme signifikant in ihrer Wachstumszeit variieren können.
8) Wenn die endgültige OD wurde der Kolben wird auf Eis erreicht und lassen inkubieren 10 Minuten Wachstum zu verlangsamen.
9) Zu einer sterilen „Resuspension vessel“ (I verwendet normalerweise sterile konische 50 ml-Röhrchen) 1 ml „30% W / V Sterile Glycerinlösung“ pro Fläschchen Sie machen mögen.
10) in der „30% W / V Sterile Glycerinlösung“ in der Aufwirbelung Gefäß ein identisches Volumen der Kulturbrühe fügt in einer 50/50 Mischung aus Brühe Glycerinlösung führt.
11) Mix durch mehrfaches Umdrehen und Ort Gefäß auf Eis für 10 Minuten zu kühlen.
12) Aliquot vormarkiert, gekühlte Kryo-Phiolen. Normalerweise aliquotieren 1 ml pro 1,2 ml-Fläschchen.
13) Ort Fläschchen bei -80 ° C für das Einfrieren und Lagerung.
14) Verwerfen verbleibenden Kulturbrühe.
15) Sie sind fertig!
Dies ist der einfachste Weg, Konsistenz in Ihren Bakterienkulturen zu gewährleisten. Transformationen können im Laufe der Zeit austrocknen oder mutieren. Ich habe das Unglück gehabt zu haben, eine alte Transformationsplatte verwendet ... die Kultur wuchs groß! Schade war es kein wirkliches Protein! In Verbindung mit einem guten Labor-Management-Tool (ich empfehle Barcodes) Sie besser organisatorische Kontrolle haben kann, die mehr Kontrolle über Ihre archivierten Bestände dann übersetzen und letztlich besseren Ausdruck Experimente. Arbeiten mit dem Glycerin-Stamm in Verbindung mit meinem 5 Tipps zur Verbesserung der Ausdruck, den Sie auf Ihrem Weg sein wird. Genießen!