Der aktuelle Status der cDNA-Klonierung
Das Klonen von cDNAs, Kopien von zellulären RNA, ist eine der klassischen Technologien in der Molekularbiologie. In den letzten 30 Jahren werden cDNA Klonen Technologien verbessern die Klonierung von großen cDNA-Sammlungen zu ermöglichen, die auf dem heutigen grundlegende Bedeutung sind Verständnis für die Nutzung genetischer Informationen. Mit der Entdeckung von RNAs, zusätzliche neue Ansätze für das Klonen von kurzen RNAs nicht-kodierenden entwickelt. Doch mit der Erkenntnis, dass viel größere Teile der Genome transkribiert werden als aus dem Genom Anmerkungen zu erwarten, steht cDNA Klonen neue Herausforderungen seltene Transkripte aufzudecken und die entsprechenden cDNAs für funktionelle Studien zu machen. Dieser Aufsatz gibt einen Überblick über den aktuellen Status von cDNA Klonen und die Möglichkeiten zur Entdeckung und Charakterisierung neuer RNA-Familien.
- cDNA-Klonierung;
- cDNA-Bibliothek;
- mRNA;
- Kleine RNA;
- Nicht-kodierende RNA;
- Expressionsklonierung
Einführung
cDNA Klonen ist eine der grundlegenden Technologien in der Molekularbiologie, und die meisten unsere Kenntnisse über Transkripte und Proteine aus der Fähigkeit abgeleiteter cDNA-Kopien von RNA herzustellen und sie in cDNA-Bibliotheken zu klonen. Beginnend mit der Entdeckung der reversen Transkriptase wurden verschiedene Protokolle für die cDNA-Bibliothek Bau wurde im Laufe der Zeit entwickelt. Verbesserungen in der Bibliothek Vorbereitung haben zur Entdeckung von Genen und der Schaffung von großen genomischen Ressourcen beteiligt. Jüngste Entdeckungen neuer Klassen von RNA und Transkripte in sehr geringen Mengen ausgedrückt erfordern neue cDNA Klonen Ansätze für solche RNAs zur Verfügung für die funktionelle Analyse zu machen. Obwohl es über den Rahmen dieses Artikels ist es, alle technischen Entwicklungen der letzten 30 Jahre zu überprüfen, wichtige Schritte in cDNA-Bibliothek Vorbereitung angesprochen allgemeinen Prinzipien der cDNA Klonen markieren (Abb. 1) und einen Überblick über den aktuellen Stand zu geben, von cDNA Klonen und zukünftigen Richtungen.
Klassische cDNA-Bibliothek Klonen. Die wichtigsten Schritte zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek gezeigt. Für weitere Details zu den einzelnen Schritten finden Sie im Text.
Reverse Transkriptasen und Erststrang-cDNA-Synthese
Die enzymatische Umwandlung von RNA in doppelsträngige cDNA wurde seit der Entdeckung der reversen Transkriptasen 1970 zur Routine geworden [1] # XA0 ;; # XA0; [2]. und verbesserte Bedingungen für die cDNA-Synthese von 1975 verfügbar wurde [3]. Reverse Transkriptasen sind RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymerasen, die entweder RNA oder DNA, um DNA-Synthese verwendet werden können. Kommerzielle Präparate des avian leukemia virus und Moloney-Stamm Murine Leukemia Virus (Mo-MLV) Reverse Transkriptase werden heute häufig verwendet, und die Entfernung der RNase H-Aktivität von Mo-MLV Reverse Transkriptasen weiter verbesserte Ausbeuten cDNA [4]. Außerdem Zugabe von T4-Bakteriophagen-Gen 32-Protein (T4gp32) kann die Synthese von langen cDNAs steigern [5] und Trehalose fidelity Enzym erhöht und ermöglicht die cDNA-Synthese bei höheren Temperaturen, [6] # XA0 ;; # XA0; [7].