Die Unterdrückung der Keratinozyten-Schichtung durch eine dominant negative Mutante JunB ohne Zelle blockiert
Einführung
In der vorliegenden Arbeit haben wir die Rolle von AP-1-Aktivität in einer humanen Keratinozyten-Zelllinie HaCaT, wenn eine geschichtete Struktur gebildet Epidermoid wurde in einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kultur untersucht. Die Blockierung von AP-1-Aktivität durch eine dominant negative Mutante JunB nicht die Zellproliferationsaktivität von HaCaT-Zellen verändern, unterdrückte aber immer noch die Bildung einer mehrschichtigen Struktur Epidermoid in einer 3D-Kultur. Darüber hinaus war die Aktivität der spezifisch auf die JunB Mutante, während die dominant negative c-Jun-Mutante nicht eine solche Aktivität hatte.
Diese Ergebnisse legten nahe, dass die AP-1-Aktivität, die durch die JunB Mutante blockiert wird, aber nicht durch den c-Jun-Mutante, wurde daher für die Bildung einer mehrschichtigen epidermoid Struktur aufgrund einiger noch unbekannten Mechanismen andere als das Zellwachstum erforderlich Verordnung.
HaCaT-Zellen in einer 3D-Kultur bei einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche
JunBδN und c-JunδN haben dominant negative Auswirkungen auf pap-1-luc-Aktivität
Um die Funktion des AP-1 zu untersuchen, erzeugten wir Deletionsmutanten von JunB und c-Jun, bezeichnet als JunBδN und c-JunδN verbunden, die ein N-terminales Transkriptionsaktivator-Domäne fehlte (1-147) (Fig. 2A). JunB, JunBδN oder C-JunδN wurde transient in HaCaT-Zellen zusammen mit c-Jun oder c-Fos ausgedrückt, wie es in Fig. 2B. Die Auswirkungen auf die AP-1-Aktivitäten wurden gemessen pAP1-luc als Reporter verwendet wird. Sowohl JunBδN und C-JunδN unterdrückt nicht nur die internen AP-1-Aktivität in HaCaT-Zellen, sondern auch die AP-1-Aktivität, induziert durch exogen exprimierten c-Jun oder c-Fos. Zwischen JunBδN und c-JunδN gab JunBδN eine stärkere dominant negative Wirkung als c-JunδN in Bezug auf die AP-1-Aktivität in diesem Reporter-Test. JunB verbesserte schwach die endogene AP-1-Aktivität von HaCaT-Zellen unterdrückt, aber die hohen AP-1-Aktivitäten in der Gegenwart von exogenem c-Jun oder c-fos (Fig. 2B).
JunBδN und c-JunδN haben dominant negative Auswirkungen auf pap-1-luc-Aktivität. (A) Schematische Darstellung der AP-1-Familie und Deletion in dieser Studie verwendeten Mutanten. (B) und C-JunBδN JunδN Unterdrückung pAP-1-luc-Aktivität in HaCaT-Zellen. pAP-1-luc wurde in HaCaT-Zellen transfiziert, zusammen mit den Expressionskonstrukten kodierend c-Jun, c-Fos, JunB, JunBδN und C-JunδN, wie angegeben. Die Luciferase-Aktivitäten wurden auf die β-Galactosidase-Aktivitäten normalisiert, um eine mögliche Veränderung der Transfektionseffizienzen zu korrigieren. Alle Werte stellen den Mittelwert ± SD (n = 3).
Wir haben festgestellt nächsten HaCaT-Zellen, die stabil JunBδN und c-Jun ausgedrückt. Western-Blotting bestätigt, dass HaCaT-JunBδN6 und HaCaT-Zellen, die ein JunBδN8 JunBδN Protein exprimiert und HaCaT-c-Jun2 und HaCaT-c-Jun12 Zellinien exprimiert exogene c-Jun (Fig. 3A), respectively. Unter Verwendung dieser Zelllinien, die AP-1-Aktivität und sind (Antioxidans-Response-Element) Aktivität wurden von Luciferase-Assays gemessen. Die AP-1-Aktivität von HaCaT-JunBδN6 und HaCaT-JunBδN8 Zelllinien war signifikant unterdrückt, während die HaCaT-c-Jun2 und HaCaT-c-Jun12 Zelllinien eine erhöhte AP-1-Aktivität hatten, wie erwartet (Fig. 3B). Auf der anderen Seite unterdrücken die JunBδN Zelllinien nicht die ARE-driven Transkriptionsaktivität, was die Spezifität des dominant negativen Effekt von JunBδN auf AP-1-Aktivität darauf hindeutet (Fig. 3C). Wir untersuchten dann die Auswirkungen von JunBδN auf HaCaT Zellwachstum. Die Wachstumskurven sind in Fig. 3D gezeigt. In Gegenwart von 5% FBS, wurde kein signifikanter Unterschied in den Wachstumskurven von HaCaT-Zellen durch die Expression von JunBδN beobachtet (Fig. 3D).
Einrichtung von HaCaT-Zellen stabil exprimiert c-Jun und JunBδN. (A) Die Expression von c-Jun in HaCaT-c-Jun2 und HaCaT-c-Jun12 Zellen und JunBδN in HaCaT-JunBδN6 und HaCaT-Zellen JunBδN8. Immunoblot Analysen wurden anti-FLAG durchgeführt unter Verwendung von und anti-β-Actin-Antikörpern. (B, C) pAP-1-luc-Aktivität (B) oder pNQO1-ARE-luc-Aktivität (C) in HaCaT-c-Jun- und HaCaT-Zellen JunBδN. Die Luciferase-Aktivitäten wurden normalisiert auf ß-Galactosidase-Aktivitäten, die mögliche Veränderung der Transfektionseffizienzen zu korrigieren. Alle Werte stellen den Mittelwert ± SD (n = 3). P-Werte, verglichen mit Mock-transfizierten HaCaT-Zellen. * P> 0,05, ** P < 0.05. (D) Growth curves of HaCaT-c-Jun, HaCaT-JunBδN and Mock-transfected HaCaT cells. All cells were seeded in 6 well plates on day 0 (3 × 10 4 cells/well). All values represent the mean (n = 3). The number of cells in each cell line showed no significant differences with the Mock-transfected HaCaT cells except for HaCaT-c-Jun2 cells on day 6.
HaCaT-JunBδN Zellen vermehren, aber nie eine mehrschichtige Struktur in 3D-Kultur schaffen
Zeitlicher Verlauf der Zellproliferationsaktivitäten und Schichtung von HaCaT-Zellen, die c-Jun, JunBδN oder C-JunδN in einer 3D-Kultur
Stratifizierung von JunB- oder c-Jun knock down HaCaT-Zellen in einer 3D-Kultur
Geschichtete Gewebebildung von JunB oder c-Jun knock down HaCaT Zellen in 3D-Kultur. (A) JunB oder c-Jun HaCaT-Zellen wurden in knock down Abschnitt experimentellen Verfahren wie angegeben festgelegt. Die Expression von JunB in HaCaT-SH (JunB) 4 und HaCaT-SH (JunB) 8 Zellen, und c-Jun in HaCaT-SH (c-Jun) 9 und HaCaT-SH (c-Jun) 17 Zellen untersucht wurden von Immunoblot-Analysen unter Verwendung eines anti-JunB, anti-c-Jun, und anti-β-Actin-Antikörper, wie angegeben. (B) HaCaT-SH (JunB) 4, HaCaT-SH (JunB) 8, HaCaT-SH (c-Jun) 9 und HaCaT-SH (c-Jun) 17-Zellen durch ein 3D-Kultivierungsverfahren kultiviert wurden, und verglichen mit Mock -transfizierten HaCaT-sh (Luc) (Control) und HaCaT-JunBδN8 Zellen am Tag 7 nach der Luftbelastung.
Gene durch eine 3D-Kultur aktiviert
Die Gene von einer 3D-Kultur in Abhängigkeit von AP-1-Aktivität aktiviert. Die mock-transfizierten HaCaT und HaCaT-Zellen wurden auf JunBδN Kollagengele kultiviert, mit oder ohne Luftexposition für 24 h. Die Gene, die Expressionsniveaus von denen verstärkt werden nach Exposition gegenüber Luft, in einer Oligonukleotid-Microarray-Analyse aufgelistet wurden Gesamt-RNA unter Verwendung von extrahierten Mock-transfizierten HaCaT-Zellen und der Expression von ausgewählten Genen durch semi-quantitativen RT-PCR bestätigt. Die AP-1-Abhängigkeit der Expression Gens wurde unter Verwendung von HaCaT-Zellen untersucht JunBδN.
Diskussion
Es ist auch interessant zu sehen, wie die Luft ausgesetzt, die AP-1-Aktivität erhöht. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielt eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung von langanhaltenden JNK-Aktivierung. Daher, oxidativer Stress, der durch Luftexposition induziert wird, wird vermutet, AP-1-Aktivität zu aktivieren. Wir haben versucht, zu prüfen, ob Kinase ASK, die direkt von ROS aktiviert, in diesem Stoffwechselweg beteiligt ist, aber keine definitive Ergebnisse so weit kommen konnte (Daten nicht gezeigt).
Experimentelle Verfahren
DNA-Konstrukte
RNAi-vermittelte Knockdown von c-Jun oder JunB wurde ausgeführt, um das pSUPER RNAi-System (Oligoengine). Die 19-bp-Zielsequenz war 5'-AGATGGAAACGACCTTCTA-3 'für c-Jun, 5'-GACCAAGAGCGCATCAAAG-3' und 5'-JunB CGTACGCGGAATACTTCGA-3 'für die Luciferase. Stabile Klone HaCaT trasfected mit pSUPER.puro-SH (JunB), pSUPER.puro-SH (c-Jun) und pSUPER.puro-SH (Luc) (Kontrolle) wurden in Gegenwart von 1 & mgr; g / ml Puromycin selektiert und gehalten (Sigma).
DNA-Transfektion und Luciferase-Assay
Die Zellen wurden unter Verwendung der FuGENE6 transfizierten Transfektionsreagenz (Roche Diagnostics) nach den Empfehlungen des Herstellers. Stabil transfizierte Klone HaCaT mit pcDNA3-FLAG-c-Jun, pcDNA3-FLAG-JunBδN, pcDNA3-FLAG-c-JunδN und pcDNA3 (Mock) wurden in Gegenwart von 300 ug / ml G418 (Gibco) selektiert und gehalten. AP-1-Aktivität in diesen Zellen wurde durch ein Luciferase-Reporter-Assay-System (Promega) unter Verwendung eines Luminometers (- G Berthold LB953 AutoLumat, EG) bestimmt. Luciferaseaktivitäten wurden normalisiert auf & bgr; -Galactosidase-Aktivität, die durch die cotransfiziert CH110 (Amersham) induziert wurde.
3D-Kultur
immunhistochemische Färbung
Immunoblotting
Zellwachstumstest
Die Zellen wurden in 6-Well-Platten in einer Dichte von 3 × 10 4 Zellen pro Vertiefung am Tag 0 ausgesät Zellzahlen zu den angegebenen Zeitpunkten wurden gezählt einer Zählkammer verwenden.
Oligonukleotid-Microarray-Analyse
Wir führten Analyse Oligonukleotid-Microarray unter Verwendung des Codelink-Systems (Amersham). HaCaT-Zellen in dem 3D-Kultursystem wurden mit oder ohne Kontakt mit Luft für 24 h. Der Gesamt-RNA wurde aus HaCaT Zellschichten mit Hilfe der RNA leicht Mini Kit (Qiagen) hergestellt. Biotinylierten cRNA synthetisiert den Protokollen des Herstellers folgen und zu einem Menschen Whole Genome Bioarray hybridisiert. Die Array-Objektträger wurden mit Streptavidin-Cy5 behandelt und mit arrayWoRx e (Applied Precision) analysiert.
Reverse Transkription (RT) -PCR
Reverse Transkription wurde mit den Erststrang-cDNA-Synthese-Kits (Takara) unter Verwendung der Gesamt-RNA, die aus 3D gezüchteten HaCaT-Zellen als Matrize durchgeführt, und die PCR wurde unter Verwendung der Primer aufgelistet wie folgt durchgeführt:
Aldo-Keto-Reduktase Family1, Mitglied B10, Vorwärts-Primer: 5'-GTCACCCATACCTCACACAG-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-AGCCATGCTTTTCTGTGATA-3'; Selenoprotein P, Vorwärts-Primer: 5'-AGAGATCAAGATCCAATGCT-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-CATCTTTGAGAGTCGTGAGA-3'; FABP4, Vorwärts-Primer: 5'-TAGGTACCTGGAAACTTGTC-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-ATATATCCCACAGAATGTTG-3'; FABP5, Vorwärts-Primer: 5'-AGGCTTTGATGAATACATGA-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-ATTGTTCATGACACACTCCA-3'; Chemokin-Liganden 14 (CXCL14), Vorwärts-Primer: 5'-GACGGGTCCAAATGCAAGTG-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-CAGGCGTTGTACCACTTGAT-3'; β-Actin, Vorwärts-Primer: 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ', Rückwärts-Primer: 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'.
Anerkennungen
Wir sind sehr dankbar, dass Drs NE Fusenig und M Yamamoto für die HaCaT-Zellen und pNQO1-ARE-luc-Reporter sind. Diese Arbeit wurde durch Grant-in-Aid for Scientific Research aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan unterstützt.
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