Wie machen kompetent E
Hasty A Method Kompetente E. Coli Vorbereiten
VERFAHREN
Skizzieren; E. wachsen bis etwa 0,4 O.D.-Einheit coli up 600 bei Raumtemperatur, und das Medium mit einem Transformationspuffer (TB) ersetzen.
1. Tag 1, morgens. Autoklav (A / C) und trockene folgende Laborware. Wenn Sie voreilig sind. abtrocknen (nehmen die Abdeckungen) in einer Reinluftkammer unter Belüftung nach der A / C.
Ein oder zwei 165mm Glasröhrchen mit Polypropylenkappe (oder Einweg sterlie 15 ml Falcon-Röhrchen)
Zwei dreieckige Glaskolben mit Alminium Folienabdeckung (eine Rücklage)
Zehn bis zwölf 2 ml Mikroröhrchen (Verwendung tolerant Rohre für die Lagerung in flüssigem Stickstoff)
Gelbe und blaue Spitzen
Bereiten Sie SOB. SOC-Medium und TB auch, wenn Sie haben keinen Vorrat von ihnen in einem Kühlschrank.
2. Tag 1, am späten Nachmittag. Dispense etwa 2 ml SOB mit einem der A / C'ed Glasrohr und 50 ml an den beiden Kolben. Beimpfen von geeigneter E. coli-Stamm in Glycerolstammlösung in SOB in dem Glasrohr 1-2uL das Lagers mit einem gelben Spitze nehmen. SOB Shop in dem Kolben in einem Kühlschrank bis zur Verwendung am nächsten Tag. Halten Sie unbedingt steril.
3. Schütteln über Nacht E. coli bei 37 ° C in einem Wasserbadschüttler zu wachsen. Es wird genug am nächsten Morgen trüb werden.
4. Tag 2, morgens. Beimpfen von etwa 0.5-2mL der E. coli-Kultur in einen des SOB in einem Kolben. In diesem Moment wird das Medium bereits leicht trübt. Shake it bei Raumtemperatur zu wachsen. Der Rest von E. coli in SOB als Glycerolstammlösung für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
6. Eis kühlen die bacteral Kultur in einem Kolben für 5min-1 Std. An dieser Stelle und später, halte Lösung E. coli eiskalte enthält sorgfältig hocheffiziente kompetente Zellen zu machen. Behandeln Sie die Lösung in einem Reinluftkammer. Übertragen Sie die Kultur in ein steriles 50 ml Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 1000-3000 xG für 10-5min bei 4 ° C.
7. Während der Wartezeit der Zentrifuge, die 2 ml Mikroröhrchen auf einem tubestand setzen und sie in einem Gefrierschrank abkühlen setzen. Nicht über-cool.
9. Zentrifuge und entsorgen Sie wie oben den Überstand. 5ml der TB. Das Pellet.
10. Fügen Sie 350uL von Dimethylsulfoxid (DMSO) und sanft sofort mischen. Mischen DMSO mit Wasser macht Wärme und hält die Bakterienlösung in einem Eiskübel. Die Bakterienzellen werden kompetent.
11. schnell, aber sanft die kompetente Zelle Lösung aliquotiert 500UL dispencing jeweils an den gekühlten 2 ml Mikroröhrchen auf der tubestand. Achten Sie darauf, nicht in die Zelle Lösung zu erwärmen.
12. Lagern Sie die kompetente Zelle in flüssigem Stickstoff oder in einer Tiefkühltruhe bei -80 ° C. Flüssiger Stickstoff gelagert kompetente Zelle ist etwa ein Jahr lang ohne Tropfen Kompetenz im praktischen Sinne gut.
TRANSFORMATION
Outline: mischte kompetente Zelllösung mit dem Plasmid, hält auf Eis für 30 Minuten, Hitzeschock geben, und über wächst für 1 Std.
1. Für conveniency die Transformationsverfahren um 15.00 Uhr beginnen, Auftauen kompetente Zelle langsam auf Eis. Nicht schütteln und über warm. Legen Sie die geschmolzene Zelllösung auf Eis beiseite.
2. Dispence einen Tropfen der Lösung oder Plasmid Ligierungsreaktion Mischung auf den Boden einer 2 ml-Eppendorf-Röhrchen zu setzen. Halten Sie unbedingt steril. Legen Sie die Röhrchen auf Eis zu kühlen.
3. Gießen 100 ul aufgetauten kompetenten Zelllösung vorsichtig auf Eis gekühlt Plasmid oder Ligierungsgemisch Lösung. Lösungen sind natürlich gemischt. Sie nicht kräftig mischen.
4. Halten Sie das Röhrchen auf Eis für 25 min.
5. Stellen Sie warmes Wasser bei 43-44C schwach oder mit Geysir sieden. Es dauert etwa 5 Minuten zu Wasser warm zu machen (25 + 5 = 30min.).
6. Legen Sie das Rohr in das warme Wasser an einem Rohr Schwimmer für 45-50sec.
7. Kühlen Sie das Röhrchen auf Eis. gehen Sie sofort zum nächsten Schritt. Ein Laborhandbuch sagt, dass es für 1-2min zu halten. auf Eis, aber es dauert etwa eine Minute für den nächsten Schritt vorzubereiten.
8. Fügen Sie 1 ml SOC und schütteln Sie sie für 40-60min bei 37 ° C. Ein Laborhandbuch sagt, um es zu 37C vorzuwärmen, aber es ist ähnlich effizient SOC gießen Sie einfach es aus einem Kühlschrank nehmen.
9. Während Schütteln. verteilt geeignete Menge an X-gal und IPTG (C.A. 20 10 ul + 20-50uL milli-Q Wasser) auf einer oder zwei LB + Amp-Agarplatte entsprechend die Kombination aus Wirtsstamm und Vektorplasmid. Ermöglicht eine Zeit lang mit dem Deckel trocknen Hälfte in einer Reinluftkammer geöffnet wird.
10. Aufstrich 100 ul SOC hinzugefügt und überwuchert Transformantenzelle Lösung auf der Agarplatte. Wenn Ligierungsreaktion Effizienz erwartet wird, gering zu sein, spült, den Rest der Lösung bei 15.000 xG nach unten, um die Zellen etwa 10-fach konzentriert. Entsorgen Sie die meisten des Mediums. Resuspendieren der Zellen in dem Rest des Mediums, und verteilt es auf eine weitere Agar-Platte. Ansonsten für die sicheren, ist es ratsam, den Rest des Transformant zur Seite in einem Kühlschrank bis zum nächsten Tag einzustellen. Wenn die Anzahl der Transformantenkolonien zu klein waren, können Sie es auf einem anderen Agarplatte wie oben Zellen auf die gleiche Art und Weise zu konzentrieren.
11. Verpackung um die Plattenabdeckung mit Parafilm. Inkubieren es upside-down über Nacht bei 37 ° C. Halten Sie die Platte in einem Kühlschrank, wenn Bakterienkolonien in dem nächsten Morgen erscheinen.
Over-Wachstum
Setzen Rohre auf einem Rotator, setzt den Rotator in einem trockenen Inkubator bei 37 ° C eingestellt, und die Röhrchen drehen. Verwenden Sie einen großen Inkubator, oder es wird für die Wärmeerzeugung aus dem Rotor zu warm geworden. Wenn es kein großer Inkubator ist noch Rotator, ist es OK, um das Wasserbad Schüttler mit einem vorgewärmten 50 ml Falcon-Röhrchen zu verwenden, in dem Sie 2 ml Röhrchen mit Seidenpapier als Verpackung setzen. Tauchen Sie die Falcon-Röhrchen über seitlich zu schütteln.
Competency Berechnung
Wenn 100 Kolonien auf einer Agarplatte erscheinen von 100 ul Lösung Transformant Aufstrich, der aus 100 ul kompetenter Zelllösung und 1 ul von 10 pg / & mgr; l Plasmid-Lösung auf die 10-fache Verdünnung von SOC gemacht wird, würde der conpetency sein
5 10 + 2 + 1 = 10 8 CFU / ug Plasmid. 100 ul kompetente Zelllösung. (10 pg x 10 5 = 1 ug, 100 = 10 2 10 1-fach verdünnt)
Chemikalien und Lösungen
SOB Medium
Für 200 ml (Mischungs die folgende Brühe und Mg-Lösung bis 100: 1 in einer sterilen Umgebung, stabil für etwa ein Jahr unter Kühlung);
Brühe
Bacto-Tripton 4g
Hefeextrakt 1 g
0,4 ml 5 M NaCl
3M KCl 0.167mL
Wasser 200 ml
A / C
SOC Medium
SOB-Medium mischt und die folgende Glucoselösung bis 100: 1 in einer sterilen Umgebung. Stabil für ein über Jahre unter Kühlung.
Glucose 3.603g
In Milli-Q-Wasser bis zu 10 ml.
A / C
TB
Für 200 ml;
PIPES 0,6 g
CaCl2. 2H2 O 0,44 g
3M KCl 16.63mL
In etwa 170 ml Milli-Q-Wasser.
Der pH-Wert auf 6,7 mit KOH-Lösung.
Hinzufügen;
MnCl 2. 4H2 O 2,18 g
Einstellen der Lautstärke mit Milli-Q-Wasser auf 200 ml.
Sterilisieren es durch 0.2 um Filter.
Stabil für mehr als ein Jahr unter Kühlung. Halten Sie es steril.
LB Amp + Agarplatte
Für 20 bis 30 Platten;
Bactotrypton 3g
Hefeextrakt 1,5 g
5M NaCl 5.134mL
Agar 4,5 g
Wasser 300 ml
A / C
Verwenden Sie einen alminium Kessel für die Bequemlichkeit.
An dieser Stelle und später, Griff etwas steril in einem Reinluftkammer bis Agarplatten abgedeckt und eingewickelt.
Kühlen Sie das LB-Agar-Medium zu 60-70C, fügen Sie 300 ul Amp Lösung. und mischen.
Gießen 10-15 ml des Mediums in einer Einweg-Kunststoffplatte, und wirbeln sie leicht den Boden der Platte zu verteilen. Zu und stapelt es.
Gießen, verwirbeln, abdecken und Stapel einer nach dem anderen, mit Flamme pulsierend Gerinnsels zu vermeiden.
Nach Agar Gerinnseln, öffnen Sie die Plattenabdeckung auf halber Strecke unter Belüftung eines Reinluftkammer-Agar für 30-60min zu trocknen. Nicht zu trocken.
Nach dem Dampf innerhalb der Abdeckung verschwunden, schließen Sie die Abdeckung, Stapel, wickeln, und speichern Sie den Kopf in einen Kühlschrank.
Gut für einen oder zwei Monate im Kühlschrank. Die Platten älter als zwei Monate können mit genutzt werden über 3-5uL Amp verteilt mit X-gal und IPTG.
5M NaCl (für 1000 ml)
NaCl 292.5g
In Milli-Q-Wasser bis zu 1000 ml.
A / C
Stabile seit Jahren unter Kühlung.
3M KCl (für 100 ml)
KCl 22.365g
In Milli-Q-Wasser bis zu 100 ml.
A / C
Stabile seit Jahren unter Kühlung.
Amp-Lösung
Ampicillin-Natriumsalz 500mg
50% Ethanol 10 ml
Stabile jahrelang in einem Gefrierschrank. Handhabung steril ist nicht erforderlich.
Kanamicine, Tetracycline
Entweder kanamicine oder Tetracyclin 500mg
Milli-Q-Wasser 10 ml
Sterilisieren durch 0.2 um Filter. Aliquat und Speicher in einem Gefrierschrank. Jahre stabil. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen.
X-gal
X-gal 100mg
Dimethylformamid 5 ml
Stall für etwa ein Jahr lang in einem Gefrierschrank. Längere sotrage macht die Lösung etwas gefärbt, aber es funktioniert immer noch in Ordnung.
IPTG
IPTG 119 mg
Milli-Q-Wasser 5 ml
Aliquotieren und lagern in einem Gefrierschrank. Gut seit Jahren.