Competent Cells - Starter Glycerol Stocks
Dieses Protokoll ist für Wissenschaftler, die kompetenten Zellen viele Male pro Jahr machen. Die Glycerin Bestände ermöglicht es Ihnen, mit wenig Vorbereitung zu beginnen.
Bereiten Sie zuerst:- 500 ml LB-Medium (10 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt in 1 L Wasser)
- 25 ml Glycerin-Lösung (65% Glycerin, 0,1 M MgSO 4, 0,025 M Tris / HCl pH 8)
- 1x 1 l-Erlenmeyerkolben autoklaviert / sterile
- 3x 10-50 ml-Kolben autoklaviert / sterile
- Agarplatten ohne Antibiotika (1 l LB + 16 g Agar)
- 2x 250 ml-Zentrifugenröhrchen für J14 Beckam Rotor autoklaviert / sterile
- Mindestens 50 Eppendorf-Röhrchen autoklaviert / sterile
- Erforderlich: Centrifuge Beckam mit Rotor J14 oder ähnlich
- Spread-Bakterien auf einer LB-Platte ohne Einsatz von Antibiotika
- Inkubiere über Nacht bei 37 ° C.
- Am Morgen dreimal eine einzige Kolonie holen und impfen 3 ml LB
- Inkubieren bei 37 ° C Schütteln (200 rpm)
- Am Abend 250 ml LB-Medium in einem 1 l Erlenmeyer impfen einer der Kulturen mit
- Inkubieren bei 37 ° C (200 Umdrehungen pro Minute) über Nacht schüttelnd
- Am Morgen bei 4000 Umdrehungen pro Minute nach unten für 10 Minuten bei 4 ° C
- Resuspendieren in 25 ml kaltes LB
- In 25 ml Glycerinlösung und gut mischen
- Store in 1 ml Aliquots bei -80 ° C
1. Spread-Bakterien auf einer LB-Platte ohne Einsatz von Antibiotika
Machen Sie drei Verdünnung Streiks und arbeiten sehr steril. Wir brauchen einzelne Kolonien im nächsten Schritt holen.
2. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
3. Am Morgen dreimal eine einzige Kolonie holen und impfen 3 ml LB
Es ist wichtig, gut aussehende groß (schnell wachsend) Kolonien zu erhalten. Dies wird das Ausgangsmaterial für alle Bestände, wenn die Kolonien sind jetzt nicht vollkommen gesunde Dinge auf der Straße für eine lange Zeit schwierig sein wird. Hier verwenden wir die sterilen 10-50 ml Flaschen.
4. Inkubiere bei 37 ° C Schütteln (200 rpm)
5. Am Abend 250 ml LB-Medium in einem 1 l Erlenmeyer-inokulieren einer der Kulturen unter Verwendung von
Verwenden Sie die eine schnellste der drei wachsen. Wir bereiteten drei Kulturen der Lage sein, jetzt zu wählen.
6. Inkubiere bei 37 ° C Schütteln (200 Umdrehungen pro Minute) über Nacht
7. Am Morgen Spin für 10 min bei 4 ° C bei 4000 Umdrehungen pro Minute nach unten
8. Resuspendieren in 25 ml kaltem LB
9. Fügen Sie 25 ml Glycerinlösung und gut mischen
10. Bewahren in 1 ml Aliquots bei -80 ° C
Dies ist nun ein konzentriertes Glycerin Lager gebrauchsfertig. Es ermöglicht Ihnen, Kulturen mit gleichen Mengen zu impfen, was die Zeit vorhersagen läßt, bis sie eine bestimmte OD erreichen.
Bekannte Probleme:
- Arbeiten sehr steril! Wir können keine Antibiotika in kompetenten Bakterien verwenden, und jede Verunreinigung wird in dem nächsten Schritt fortgepflanzt werden. Sie werden dies nur tun, wenn in einer langen Zeit, nehmen Sie sich Zeit und so gut arbeiten wie möglich!
Ich begann, um kompetente Zellen auf diese Weise, wenn ich kompetente Zellen für das ganze Labor machen musste. Es sparte wirklich einige Zeit dauern.
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